本发明涉及单克隆抗体，尤其是涉及以体外培养的人白血病细胞kg-1作为免疫原，腹腔注射免疫小鼠，通过凝集筛选获得的一种抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
在以往研究中，人们发现在体外培养的转化细胞、动物肿瘤细胞和人肿瘤细胞中存在着大量的内源性凝集素(endogenouslectins,el)。凝集素是一类能识别并特异性结合细胞上专一性糖基的非免疫源性蛋白质或糖蛋白(王少元,吕联煌,黄明清.急性白血病细胞凝集素受体的研究[j].福建医学院学报,1993(04):294-297)，其中一些是肿瘤细胞特有的，可以作为一种新的肿瘤标记物，而且与肿瘤生长、肿瘤的恶性程度、肿瘤转移及肿瘤病人的免疫状态密切相关。深入研究肿瘤凝集素不仅对揭示肿瘤的本质具有重要的理论依据，而且对于判断肿瘤的生长状态、病理分期及临床病情也具有一定的实际意义(gabiushj.endogenouslectinsintumorsandtheirpossibleimportanceinthediagnosisandtherapyofcancers[j].onkologie,1989,12(4):175-181)。
近年有研究表明(toscanoma,ilarreguijm,biancoga,campagnal,crocido,salatinom,rabinovichga.dissectingthepathophysiologicroleofendogenouslectins:glycan-bindingproteinswithcytokine-likeactivity？[j].cytokine&growthfactorreviews,2007,18(1-2):57)，凝集素和肿瘤凝集素受体的相互作用或许会产生相反的结果，在初期发展阶段，癌细胞会通过唾液酸帽状聚糖分子来保护自身不被消灭，但是一旦肿瘤建立了稳固的地位，其后期的生长就会通过巨噬细胞产生的凝集素来抑制。提示凝集素或是介导促肿瘤或抑制肿瘤的开关。
有研究表明(徐敏琳,王世泂.白血病细胞促凝集活性的初步研究[j].浙江医学,1996(01):14-15)，凝集素的活性与白血病的活动密切相关，高活性的凝集素是恶性肿瘤的一个重要特征，凝集素可以作为衡量白血病活动状态的重要指标，对于连续动态观察疾病进展有重要的意义。为此，制备白血病细胞凝集性抗体将对白血病的研究和临床治疗有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1)制备免疫原；
在步骤1)中，所述制备免疫原的具体方法可为：通过体外大量培养人白血病细胞kg-1，将获得的细胞作为免疫原，免疫balb/c小鼠；
2)动物免疫；
在步骤2)中，所述动物免疫的具体方法可为：balb/c小鼠腹腔注射人白血病细胞kg-1，2×106/次，每次免疫间隔两周，免疫5次。
3)小鼠血清凝集效价测定；
在步骤3)中，所述小鼠血清凝集效价测定的具体方法可为：
(1)将血清稀释到适当浓度，取30μl到凝集板孔中；
(2)向各孔加入人白血病细胞kg-1细胞悬液40μl(细胞浓度为4×104/ml)；
(3)向各孔加入兔抗鼠二抗30μl(1︰1000稀释)；
(4)室温下在振荡器上振荡30min，后在显微镜下观察结果；
(5)结果判定：显微镜下观察细胞，根据聚合状态判定凝集强弱，聚集成一团或多团，为全部凝集(++++)，有凝集现象的为(+)，不凝集者(-)细胞自然沉于孔底呈密集状。
4)细胞融合、筛选及克隆化；
在步骤4)中，所述细胞融合、筛选及克隆化的具体方法可为：取血清凝集效价最高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0在peg介导下体外融合，阳性细胞株经三次亚克隆后，获得一株稳定分泌凝集性单克隆抗体细胞株，命名为k43。
5)抗体的制备与纯化。
在步骤5)中，所述抗体的制备与纯化的具体方法可为：将稳定分泌的细胞株体外扩大培养后，腹腔注射小鼠产生腹水，腹水经提取、纯化后得到抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体。
所制备的抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体可进行凝集实验鉴定，结果表明，抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体具有很强的凝集性能。
本发明采用活细胞直接对小鼠多次进行腹腔注射的免疫方式，制备抗人白血病细胞kg-1凝集性单克隆抗体，并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为人白血病凝集性抗体的应用研究奠定基础。
本发明通过高效的单克隆抗体制备技术，以体外培养的人白血病细胞kg-1作为免疫原，腹腔注射免疫小鼠，通过凝集筛选获得能促使人白血病细胞kg-1产生特异性凝集反应的单克隆抗体。其单克隆抗体的获得将对白血病的研究和临床治疗有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例的抗体纯化sds-page电泳鉴定结果。在图1中，1为bsa；2为纯化的抗体。
图2为本发明实施例的抗体凝集实验结果。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1、材料
balb/c纯系小鼠，雌性，6周龄(购自上海斯莱克公司)；sp2/0骨髓瘤细胞株(购自上海中科院细胞所)；人白血病细胞kg-1(购自atcc)；rpmi1640(购自gibco公司)；fbs胎牛血清(购自gibco公司)；hat(购自sigma公司)；ht(购自sigma公司)；peg溶液(购自sigma公司)；兔抗鼠二抗(购自sigma公司)；hrp标记的羊抗鼠免疫球蛋白(购自sigma公司)；rproteina柱(购自gehealthcare公司)；bsa(购自sigma公司)。
2、方法
2.1免疫原制备：将人白血病细胞kg-1于含有10％fbs的rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2培养箱培养。
2.2动物免疫：取对数生长期的人白血病细胞kg-1，pbs洗涤2次，每次每只腹腔注射细胞2×106/个，每次免疫间隔两周，免疫5次。
2.3小鼠血清凝集效价测定：采用用凝集法。具体步骤：(1)将血清按1:500开始倍比稀释，取30μl到凝集板孔中。(2)向各孔加入人白血病细胞kg-1细胞悬液40μl(细胞浓度为4×104/ml)。(3)向各孔加入兔抗鼠二抗30μl(1:1000稀释)。(4)室温下在振荡器上振荡30min，后观察结果。(5)结果判定：显微镜下观察细胞，根据聚合状态判定凝集强弱，聚集成一团或多团，为全部凝集(++++)，有凝集现象的为(+)，不凝集者(-)细胞自然沉于孔底呈密集状。
2.4细胞融合、筛选及克隆化：取小鼠脾细胞与sp2/0细胞(5︰1)与peg介导下进行融合，hat选择培养，收集杂交瘤上清，用上述凝集方法进行筛选，阳性孔杂交瘤细胞经3次有限稀释克隆化。
2.5腹水制备：在每只balb/c小鼠腹腔内注入0.5ml液体石蜡，10天后同法每只注入已培养的杂交瘤细胞106个，10天后小鼠腹部明显隆起，手触有波动感，用16号针头采集腹水，3000r/min，离心10min，收集上清，-20℃冻存。
2.6抗体纯化：用亲和层析法对腹水抗体进行纯化。方法如下：用buffera(0.05mol/lboricacid,4.0mol/lnacl,ph9.0)平衡柱子，加适量的腹水，用buffera冲洗柱子，再用bufferb(0.05mol/lsodiumphosphate,0.05mol/lsodiumcitrate,0.3mol/lnacl,ph3.0)洗脱。收集蛋白加入5％体积的1.0mol/ltris-hcl，ph8.0调节ph值，收集蛋白进行sds-page电泳，分析纯度。
2.7抗体鉴定：将纯化后的抗体稀释至10000倍进行凝集实验，同时设立对照组，30min后观察凝集结果。
3、结果
3.1免疫效果小鼠5次免疫后，3组小鼠所产生的血清抗体凝集强度对比如表1所示，结果表明3组免疫小鼠都能产生凝集性抗体，其中a组凝集价为1︰2000，b组凝集价为1︰4000，c组凝集价为1︰2000，d组(对照组)不凝集。
表1
3.2杂交瘤细胞系的建立与克隆取脾细胞与sp2/0细胞融合后hat培养基培养，一周左右部分孔见细胞克隆性生长，两周后细胞生长超过孔底面积1/3，融合成功率为90％，经3次克隆化后获得一株稳定分泌凝集性抗体的杂交瘤细胞株，命名为k43。
3.3抗体纯化k43杂交瘤细胞制备的腹水经rproteina亲和层析纯化，在mr大约为50000和25000处呈现两条带(条带2)，分别相当于抗体的重链和轻链的相对分子量，如图1所示。sds-page凝胶电泳扫描分析其纯度为90％，抗体浓度为1.2mg/ml，表明通过纯化，获得较高纯度的抗体。
3.4抗体纯化后凝集性能测定纯化的抗体进行凝集实验，反应30min后，肉眼可见白血病细胞kg-1出现明显凝集现象，结果如图2所示，表明纯化后的抗体仍然保持良好的凝集活性。