本发明属于基因编辑技术领域，涉及分子生物学，具体而言是基于crispr/cas9技术构建一种icam-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用。
背景技术：
肿瘤细胞术后复发转移是癌症患者高死亡率的主要原因，尚无有效防治方法。例如肝癌根治性切除术后的复发率高达60%-80%，其术后较高的复发率成为影响肝癌术后康复的主要障碍。
人乳腺癌(hela)细胞是肿瘤粘附转移研究的经典模式细胞，传统的基因编辑工具只能瞬时沉默或者敲减目标基因。利用crispr/cas9技术敲除目标基因后，常用的有限稀释法过于繁琐与耗时。若能使用新的阳性单克隆挑取方法，有效构建一种稳定、完全敲除icam-1基因hela细胞株将大大有利于探索icam-1在肿瘤粘附转移中达到的关键作用，促进相互作用于icam-1相关细胞因子的研究发现，为肿瘤粘附转移搭建了新的研究平台。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种icam-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用。包括构建有效的靶向人源icam-1基因sgrna重组敲除质粒载体，以及筛选得到稳定传代的icam-1双拷贝敲除的hela细胞株的方法。
为了实现本发明的所述目的，采用以下实验技术方案：
采用crispr/cas9技术敲除目标基因，crispr/cas9是基于细菌和古细菌天然防御机制的一项技术，可广泛用于哺乳动物细胞基因编辑，在rna的介导下，cas9蛋白能够对识别的靶向目标序列进行切割。该系统能特异识别目标基因原间隔序列的5'端和3'端延伸的几个碱基为ngg形式，称之为原间隔序列临近基序（protospaceradjacentmotifs，pam），cas9蛋白形成复合物对该位点进行切割。本发明筛选提出一种有生物活性，高效且不易脱靶的pam靶点sgrna。
选取可表达crispr/cas9基因编辑系统的敲除质粒为px459vector，此质粒同时带有puromycin抗性，可供阳性单克隆细胞筛选。
如上述的重组icam-1敲除重组px459质粒载体的构建方法，如下步骤：
1）使用ncbi检索人源icam-1基因核酸序列，选取cds区进行靶向sgrna序列设计，得靶向icam-1基因sgrna，即icam-1-sgrna，序列为tttctcgtgccgcactgaac。
2）合成icam-1-sgrna正向及反向寡核苷酸序列，并在合成时两端加上bbsi酶切位点。将得到的互补正反向寡核苷酸序列在梯度pcr仪中完成退火反应从而形成双链寡核苷酸。
3）将bbsi酶切后的px459质粒载体回收，通过t4连接酶与双链icam-1-grna连接形成重组基因敲除载体。通过氨苄青霉素抗性的lb培养基扩大培养单克隆菌种，测序验证阳性菌种单克隆，提取质粒得到所需icam-1-grna/cas9重组敲除crispr载体。
一种hela细胞敲除icam-1基因以及筛选阳性克隆的方法，具体操作如下：
1）使用lipo2000，质粒与lipo质量比例1:2，将上述所得重组敲除质粒转染六孔板中hela细胞。24h后，使用puromycin抗生素进行筛选。
2）连续药筛三天，换为正常培养液培养，待长成各个一簇一簇单克隆细胞团。
3）使用胰酶消化单克隆细胞团，弃去胰酶。使用枪头挑取各个单克隆细胞团进入96孔板已加入100μl培养液孔中，待贴壁后保持定期的换液。确保单克隆细胞的增殖生长。
设计并合成包含上述sgrna序列的600-800bp的上下游引物，引物序列为：
forward:ttcgtctgttaggcaggcagcaag；
reverse:tgtgagcagacagggatggac。
4）待96孔板中单克隆细胞增殖，移转入六孔板提取基因组。使用合成的引物pcr，通过胶回收得到目的片段dna（见图1），测序比对野生型基因组，检测sgrna序列的基因修饰。
5）若测序图谱出现双峰，或者sgrna序列区域出现碱基改变（见图2）。采用t-acloning实验验证hela细胞icam-1的基因敲除。由于人染色体为二倍体，需验证双拷贝icam-1基因的敲除。
6）通过t-acloning实验测序检测到双拷贝icam-1基因皆为敲除型。如上述基因敲除方法，则得到纯种可稳定遗传的icam-1基因敲除hela细胞株。
本发明的优点在于：
1.本发明所采用的sgrna寡核苷酸序列具体良好的生物活性，能够高效的靶向人源肿瘤细胞中的icam-1基因。
2.相比较传统的细胞单克隆有限稀释筛选法，本发明所采用适用于贴壁细胞的单克隆挑取法具有更强的实用性并且大大缩减了实验操作周期。
1）经胰酶孵育不重悬，能够直接挑取单克隆细胞团单一类型的细胞培养。
2）省去了有限稀释大量的实验操作。
3）能够保持原始单克隆细胞团的形态，当验证失败后可以重复挑取新的单克隆细胞。
4）此敲除细胞株具有明显的抗肿瘤粘附能力，提供了抗肿瘤转移研究新的研究平台。
5）可作为模式细胞，进行抗肿瘤药物的筛选与鉴定，并进行靶向分析。
附图说明
图1目标片段pcr电泳图。
图2单克隆细胞测序双峰及序列比对图。
图3对比野生型细胞icam-1敲除株细胞粘附图。
具体实施方式
实施例1
1.crispr/cas9系统敲除靶点sgrna设计
选择张峰实验组的crisprdesign：http://crispr.mit.edu/。选取icam-1的cds区域序列，每次设计只使用其中一个外显子序列，避免设计的sgrna跨越两个外显子，无法于基因组上匹配相应序列。通过设计得到一条20bp的oligodna（sgrna）：tttctcgtgccgcactgaac。
在合成时，需在序列前后加上bbsi酶切后的互补碱基（加粗处），从而能够直接与酶切后的敲除载体连接。
正链sgrna：caccgtttctcgtgccgcactgaac；
负链sgrna：aaacgttcagtgcggcacgagaaac。
2.icam-1基因敲除重组载体的构建
1）合成2od，溶解为100μm。各使用2μl，单链oligo退火步骤如下：
各组分依次加入后轻轻混匀，之后低速离心。温度梯度95℃，10min；95℃-85℃，2.5℃/s；85℃-25℃，0.25℃/s；25℃5min。
2）双链grna与crispr/cas9敲除载体px459的连接体系：
低速离心混匀。16℃水浴过夜。然后放于4℃冰箱保存。
3）转化：
1.5μl离心管中加入感受态细胞（dh5α）50μl，然后温和的加入连接产物3μl混匀，冰浴30min；42℃水浴，45s之后冰上2min；加入800μllb；37℃摇床培养1h；室温4000rpm，离心5min；弃上清750μl；剩余菌液混匀涂板，采用amp平板；封口，37℃倒置过夜。
4）挑取单克隆并测序比对：
挑选生长均匀的单克隆，每板挑选3个单克隆，加入3mllb。37℃摇床培养14小时。再扩大培养后，吸取每个单克隆菌液300μl送至测序公司使用u6启动子测序引物测序，使用bioedit软件进行比对分析，证实grna成功连接入载体质粒。
3.lipo2000转染hela细胞，具体步骤如下：
首先取状态良好的hela细胞铺于六孔板，待密度增殖至70%进行实验。之后取opti-mem转染培养基50μl分别混合2.5μg敲除质粒与4μllipo2000溶液。充分混匀后，将重组质粒溶液轻轻加入lipo2000溶液中，枪头来回吹打混匀，静置10min。最后均匀加入细胞培养液中。6h后换新鲜培养液，24h后即可进行抗生素筛选。
4.hela细胞嘌呤霉素（puro）抗性最小致死浓度筛选
hela细胞96孔板铺板，每孔5×103个细胞，待细胞贴壁生长后，加入不同浓度的puro（0.1、0.5、1、2μg/ml），每个浓度三个复孔，每天换液并保持相同药物浓度，3天后显微镜观察细胞存活状况，选择细胞最低全致死浓度作为单克隆细胞puro药筛的标准浓度。经过实验得出结论，puro药物筛选浓度为1μg/ml。
5.单克隆细胞的挑取与生长增殖
停止药物筛选后的细胞逐渐形成簇状单克隆细胞团，使用胰酶孵育单克隆细胞团，置入37℃培养箱1min，吸去胰酶（操作时尽量不碰触细胞）。传统的有限稀释法重悬细胞，通过不断的稀释细胞浓度至单个细胞。本发明中保持单克隆细胞团保持胰酶加入前的状态，采用10μl枪头轻触挑取单个单克隆细胞团进入96孔板已加入100μl培养液的小孔中，不要掺杂其他细胞团细胞。待增殖后胰酶消化转入6孔板，即可提取基因组作为模板。
6.敲除验证引物的设计及目标片段pcr
以本发明设计sgrna前后序列600-800bp序列为目标片段设计引物，采用primer5引物设计软件。设计引物如下：
f-primer：ttcgtctgttaggcaggcagcaag；
r-primer：tgtgagcagacagggatgga。
pcr扩增得到目标片段，pcr混合酶premixtaq购至takara。具体实验体系：
pcr反应流程：
实施例2icam-1敲除的应用
icam-1作为细胞粘附因子，在肿瘤的转移初始步骤中起着重要的作用。通过肿瘤与血管内细胞粘附实验：使用血管内皮细胞huevc先铺板于96孔板，37℃，5%co2培养箱，贴壁12h。分为两组，两组分别为添加与不加刺激因子tnf-α组（tnf-α能够诱导icam-1表达增高），两组同时各自加入100μl荧光染料标记的野生型肿瘤细胞与icam-1敲除肿瘤细胞(3×104/ml)培养基悬浮液，pbs溶液清洗3次，洗去未粘附的细胞。共四组于荧光显微镜下拍照，计算药物对细胞粘附抑制率。我们发现icam-1敲除肿瘤细胞粘附能力明显降低，加刺激因子后显著性降低，原因可能在于tnf-α也能够诱导其他粘附相关因子的表达，但粘附能力依旧较野生型细胞组降低（图3）。因此，我们认为icam-1基因敲除导致肿瘤细胞株的粘附能力下降，从而能够影响肿瘤侵袭转移方面的能力。icam-1敲除hela细胞株可用于作为肿瘤转移研究模型细胞，同时为将来的抗肿瘤转移药物筛选提供了极大的便利。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福州大学
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