本发明属于蛋白质工程领域，通过蛋白质工程改造使一种酶可以有效的利用各种羧酸合成相应的线性ɑ-烯烃，具体地，涉及一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂olet-bm3r的序列、制备方法及其应用。
背景技术：
线性ɑ-烯烃(linearɑ-olefins,laos)是理想的下一代能源物质，并且是合成表面活性剂、润滑油、洗涤剂、添加剂以及聚合物重要的工业原料。因此，laos的应用具有广阔的市场前景。目前，laos主要是从传统石油工业产品乙烯聚合而成，通过这一方法获得的烯烃均为偶数个碳长，这导致奇数个碳长的烯烃价格异常昂贵。此外，随着日益减少的化石能源的储备，寻求可再生的途径生产烯烃变得尤为迫切。
以在自然界中具有丰富的储备且生物体本身能合成的脂肪酸(fas)为原料通过脱羧作用合成laos是更为直接和便捷的方法。自然界中脂肪酸多以偶数碳为主，通过脱羧就能够直接获得奇数个碳长烯烃，从而填补聚乙烯工业在生产奇数个碳长烯烃的空白。目前已有的以脂肪酸为底物合成相应的laos的方法有利用过渡金属催化脱羧的化学合成法，其通常需要剧烈的反应条件，并且需要原位蒸馏保持产物的ɑ选择性，为了激活底物而加入的酸酐会产生多余的废弃物。显然，这种方法并不是一种绿色环保的方法。
2011年发现的咸海鲜球菌(jeotgalicoccussp.atcc8456)脂肪酸脱羧酶oletje能够利用h2o2作为氧化剂和电子供体将饱和脂肪酸脱羧形成末端烯烃。这个仅有一个酶参与、利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧的反应是目前已知最为简单的合成laos的酶催化反应。其优点不仅包括脂肪酸原料的易获得性以及反应步骤的简洁性，相较于金属催化的化学合成方法，该反应的突出特点还在于：反应在环保的水溶液中进行、反应条件温和(室温)、低能耗等。但h2o2不稳定，易使oletje失活，而且所有依赖h2o2的脱羧反应系统普遍具有低催化效率和有限的底物范围。
oletje脱羧反应也可以与其他的氧化还原蛋白系统偶联，能够实现利用空气中的o2作为氧化剂，生物体中的辅酶nad(p)h作为电子供体的脂肪酸的脱羧产末端烯烃反应。但是目前已知的耦联氧化还原蛋白的催化系统也都存在催化效率低，底物范围有限，以及复杂的反应体系导致的操作繁琐等问题，因而限制了它们的应用前景。
技术实现要素：
为了降低线性ɑ-烯烃合成对石油工业的依赖，弥补现有工业方法无法生产奇数碳链长度线性ɑ-烯烃的缺陷，克服基于金属催化剂化学合成线性ɑ-烯烃方法高能耗、反应体系条件剧烈、产生不利于环境的废料等问题，以及解决现有酶反应体系产率低、底物范围窄、反应体系复杂等问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化效率高，底物范围广，反应体系更简洁的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂脂肪酸脱羧酶olet-bm3r。
本发明的第二个目的是提供该脂肪酸脱羧酶的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供制备该脂肪酸脱羧酶的方法。
本发明的第四个目的是提供脂肪酸脱羧酶olet-bm3r催化脂肪酸脱羧合成ɑ-烯烃的方法或脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂olet-bm3r，其特征在于：将咸海鲜球菌(jeotgalicoccussp.atcc8456)脂肪酸脱羧酶oletje与巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)脂肪酸羟化酶cyp102a1(p450bm3)的还原酶结构域融合得到生物催化剂olet-bm3r，用于催化以脂肪酸为底物生成ɑ-烯烃的反应。
一种编码所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂olet-bm3r的氨基酸序列，所述氨基酸序列如seqidno:1所示。
一种编码所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂olet-bm3r的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno:2所示。
一种制备前述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂olet-bm3r的方法，包括如下步骤：
(1)构建表达脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的质粒：将上述seqidno:2的核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；
(2)将步骤(1)构建的表达脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的质粒转化到大肠杆菌中；
(3)脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的表达：将步骤(2)得到的菌种在lb液体培养基中过夜培养之后，加入tb液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和iptg诱导表达后，离心收菌；
(4)含有脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤(3)中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
(5)脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的纯化：将步骤(4)的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有his标签的目的蛋白与镍柱结合，然后于较低咪唑浓度下除去杂蛋白，最后用含有高浓度咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱；
(6)将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后冻干制成冻干粉，-20℃保存。
脂肪酸脱羧酶olet-bm3r的制备方法，具体步骤为：
olet-bm3r的基因表达载体的构建：将全基因合成的olet-bm3r片段，经限制性内切酶ndei和xhoi依据说明书进行双酶切操作后，用t4连接酶连接到被ndei和xhoi双酶切过的表达载体pet28a上；用连接产物转化大肠杆菌dh5ɑ感受态细胞；从含有50μg/ml卡那霉素的固体lb培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养；从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定；
olet-bm3r的制备：将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌rosetta(de3)中，将阳性克隆挑入5ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素lb液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素tb液体培养基，在37℃，摇床转速220rpm下进行扩培；待od600约为0.6时，加入终浓度为0.5mm的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.1mm的iptg诱导；在22℃，摇床转速220rpm下表达20h后，离心转速5000rpm离心10min收菌；舍弃上清培养基后，用50ml的buffera(0.1mkpi，0.3mkcl，ph7.0)将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000rpm，离心45min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以buffera(0.1mkpi磷酸钾，0.3mkcl，ph7.0)预处理的20ml镍离子亲和柱，使带有his标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含10mm，35mm咪唑的bufferc(10mm或35mm咪唑，0.1mkpi磷酸钾，0.3mkcl，ph7.0)除去杂蛋白，并用bufferb(0.1mkpi，0.3mkcl，250mm咪唑，ph7.0)将olet-bm3r从柱上洗脱下来；olet-bm3r的纯度由sds-page鉴定；将洗脱下的olet-bm3r用buffera4℃下过夜透析，以除去咪唑；最终将olet-bm3r蛋白冻干制成冻干粉，-20℃下保存。
采用脂肪酸脱羧酶olet-bm3r催化合成线性ɑ-烯烃的基本方法：在反应容器中分别加入反应缓冲液,脂肪酸脱羧酶olet-bm3r冻干粉，底物，过氧化氢酶，nadph；室温下反应。在此基础上，可以利用大肠杆菌自身代谢的nadph来推动反应，无需额外添加nadph，具体为：在反应容器中分别加入olet-bm3r的制备方法中步骤(4)获得的上清液，底物，过氧化氢酶；室温下反应。为降低nadph的使用量，可以在以上两种反应的基础上，加入亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶形成nadph的循环再生系统。
所述的底物为有机羧酸；所述的反应缓冲液成分为：0.1mkpi(磷酸钾)，0.3mkcl，ph7.0。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明中提供的线性ɑ-烯烃合成酶olet-bm3r利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧其优点不仅包括脂肪酸原料的易获得性以及反应步骤的简洁性，相较于金属催化的化学合成方法，该反应的突出特点还在于：反应在环保的水溶液中进行、反应条件温和(室温)、低能耗等。融合了巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)脂肪酸羟化酶cyp102a1(p450bm3)的还原酶结构域使得该酶摆脱了对不稳定的、与生物体系不兼容的h2o2的依赖，且较已知酶催化脂肪酸合成ɑ-烯烃方法，具备了反应体系得到简化(不需要额外投入一定比例含有其他氧化还原蛋白的发酵液)、反应活性有所提高、反应底物范围宽(饱和脂肪酸c4-c20，以及末端带不同官能团的羧酸如：双键、苯环、环烷基、酮、醛、卤素、羟基、双羧酸等)等优点。该酶具有较好的的稳定性——在37℃水浴24h后几乎没有活性的损失。制成的冻干粉可以保存在-20℃数月后依然没有影响其催化活性。
同时该反应可以偶联如亚磷酸脱氢酶(ptdh)等的nadph再生系统，以廉价的反应物(如亚磷酸钠)作为最终的电子来源为反应持续的提供nadph，因此大大降低生产成本。并且olet-bm3r/ptdh系统能在较少的催化剂用量(～0.02mol％)下，能够获得高达到2.51gl-1的产率以及209.2mgl-1h-1的体积产率，为目前已知酶催化产烃类效率最高的反应。同时含有该酶的发酵液在不加入nadph的反应体系中就能直接催化脂肪酸脱羧，这不仅使得生产成本变得更低，更省略蛋白纯化的步骤使得劳动成本降低，提高生产效率。上述所有的特质说明了这个融合蛋白在生物能源和工业生产方面的应用价值。
附图说明
图1是olet-bm3r的构建结构图和olet-bm3r(冻干粉)耦合基于ptdh的nadph循环系统利用o2催化羧酸脱羧形成烯烃的示意图；其中图1a为olet-bm3r的构建结构图，olet-bm3r由oletje(粉色)，p450bm3的fmn结合结构域(蓝绿色)，p450bm3的fad/nadph结合结构域(蓝色)组成，辅因子：血红素，fmn，fad，nadp+的结构由棒状模型表示；图1b图示了olet-bm3r(冻干粉)耦合基于ptdh的nadph循环系统利用o2催化羧酸脱羧形成烯烃。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特定说明，以下所有的化合物和试剂都是从sigma-aldrich,emdmillipore,tokyochemicalindustry，生工生物工程(上海)有限公司购买，纯度均>99％。
实施例1olet-bm3r的基因表达载体的构建
将全基因合成的olet-bm3r片段(序列如seqidno：2所示，由苏州金唯智生物有限公司合成)，经限制性内切酶ndei和xhoi(newenglandbiolabs公司)依据说明书进行双酶切操作后，用t4连接酶(newenglandbiolabs公司)连接到被ndei和xhoi双酶切过的表达载体pet28a上。用连接产物转化大肠杆菌dh5ɑ感受态细胞(天根生化科技有限公司)。从含有50μg/ml卡那霉素的固体lb培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养。从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒(天根生化科技有限公司)，依据说明书提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定(苏州金唯智生物有限公司)。
实施例2olet-bm3r的制备
(1)将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌rosetta(de3)(天根生化科技有限公司)中，将阳性克隆挑入5ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素lb液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素tb液体培养基，在37℃，摇床转速220rpm下进行扩培。待od600约为0.6时，加入终浓度为0.5mm的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.1mm的iptg诱导。在22℃，摇床转速220rpm下表达20h后，离心转速5000rpm离心10min收菌。舍弃上清培养基后，用50ml的buffera(0.1mkpi磷酸钾，0.3mkcl，ph7.0)将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000rpm，离心45min，获得上清细胞裂解液；
(2)将上述细胞裂解液加入事先以buffera预处理的20ml镍离子亲和柱，使带有his标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含10mm，35mm咪唑的bufferc(10mm或35mm咪唑，0.1mkpi磷酸钾，0.3mkcl，ph7.0)除去杂蛋白，并用bufferb(0.1mkpi，0.3mkcl，250mm咪唑，ph7.0)将olet-bm3r从柱上洗脱下来；olet-bm3r的纯度由sds-page鉴定，一般纯度>98％。将洗脱下的olet-bm3r用buffera4℃下过夜透析，以除去咪唑。最终将olet-bm3r蛋白冻干制成冻干粉，-20℃下保存。在此条件下保存的olet-bm3r制品一年内无明显活性变化。
实施例3利用olet-bm3r冻干粉联合基于ptdh的nadph再生系统催化天然饱和脂肪酸合成相应ɑ-烯烃
反应体系：buffera，olet-bm3r(3μm)，脂肪酸(1mm)(脂肪酸c4-c11助溶剂：5％etoh(v/v)，脂肪酸c12-c20助溶剂：5％etoh(v/v)和1.5％tritonx-100(v/v))，过氧化氢酶(100uml-1)，亚磷酸钠(10mm)，ptdh亚磷酸脱氢酶(2μm)，nadph(200μm)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。各天然脂肪酸脱羧合成烯烃的产率：c4：14％，c5：11％，c6：68％，c7：70％，c8：40％，c9：47％，c10:70％，c11：58％，c12：46％，c14：52％，c16：60％，c18：73％，c20：70％。
实施例4利用olet-bm3r冻干粉联合基于ptdh的nadph再生系统催化非天然脂肪酸合成相应ɑ-烯烃
反应体系：buffera，olet-bm3r(3μm)，脂肪酸(1mm)(助溶剂：5％etoh(v/v))，过氧化氢酶(100uml-1)，亚磷酸钠(10mm)，ptdh(2μm)，nadph(200μm)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。各非天然脂肪酸脱羧合成烯烃的产率：环己甲酸(cyclohexanecarboxylicacid)：30％，2-甲基己酸(2-methlyhexanoicacid)：30％，3-苯基丙酸(3-phenylpropionicacid)：78％，3-(4-氟苯基)丙酸(3-(4-fluorophenyl)propionicacid)：44％，10-十一碳烯酸(10-undecenoicacid)：71％，10-羰基十一酸(10-oxoundecanoicacid)：48％，12-羟基十二酸(12-hydroxydodecanoicacid)：42％，11-溴十一酸(11-bromoundecanoicacid)：40％，15-醛基十五酸(15-oxopentadecanoicacid)：11％，十二烷二酸(dodecanedioicacid)：42％。
实施例5用olet-bm3r冻干粉催化1g(3.52mmol)硬脂酸合成1-十七烯
反应体系：buffera，olet-bm3r(3μm)，硬脂酸(1g)，助溶剂5％etoh(v/v)和1.5％tritonx-100(v/v)，过氧化氢酶(100uml-1)，亚磷酸钠(50mm)，ptdh(2μm)，nadph(200μm)，400ml体系，室温，摇床转速125rpm，反应20小时。反应结束后，产物用乙酸乙酯萃取，得到的有机相中加入无水硫酸镁除去多余的水后旋蒸浓缩。浓缩过的有机相通过硅胶柱层析方法(洗脱剂：正己烷)纯化后旋蒸，得到纯度>99％的1-十七烯503.6mg(产率：60％)。
实施例6利用olet-bm3r冻干粉催化40mm硬脂酸合成1-十七烯
反应体系：buffera，olet-bm3r(9μm)，硬脂酸(40mm)，助溶剂5％etoh(v/v)和1.5％tritonx-100(v/v)，过氧化氢酶(100uml-1)，亚磷酸钠(50mm)，ptdh(2μm)，nadph(200μm)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。最后得到1-十七烯的产率为26％，2.51gl-1以及209.2mgl-1h-1的体积产率。
实施例7利用olet-bm3r发酵液催化10mm硬脂酸合成1-十七烯
细胞裂解液的制备同实例2(1)。反应体系：含有olet-bm3r的发酵液(5μm)，硬脂酸(10mm)，助溶剂5％etoh(v/v)和1.5％tritonx-100(v/v)，过氧化氢酶(100uml-1)，亚磷酸钠(50mm)，ptdh(2μm)，1ml体系，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。最后得到1-十七烯的产率为53％，1.26gl-1以及105.0mgl-1h-1的体积产率。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110>扬州大学
<120>催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂olet-bm3r的序列、制备方法及其应用
<130>xhx2018042701
<141>2018-04-27
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1016
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