本发明涉及一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术：
近年来,食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题。食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病，主要是由食物中蛋白质引起，由ige介导的ⅰ型超敏反应，其临床症状主要有水肿、皮炎、哮喘以及肠道综合症等，严重时会引发休克甚至危及生命，复杂食物样品中微量过敏原的检测和定量成为当务之急。甲壳类动物是联合国粮农组织提出的8大类易过敏食物之一，甲壳类动物主要过敏原为分子质量约为36-38kda的虾原肌球蛋白。目前体外针对微量过敏原的检测方法有免疫学方法、蛋白组学法、pcr法、化学发光免疫方法。虽然目前有关过敏原检测的方法很多,但都存在各自不同的问题,如检测速度慢、成本高、检测需要特定的分析仪器等,制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。
与其他过敏原检测方法相比，酶联免疫法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。
技术实现要素：
本发明的目的是提供虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，建立检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心elisa法。
本发明的第一个目的是提供一种虾原肌球蛋白单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为cgmccno.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供一种虾原肌球蛋白单克隆抗体，由保藏编号为cgmccno.14690的单克隆细胞株分泌产生。
本发明的第三个目的是提供虾原肌球蛋白单克隆抗体的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于食品中虾原肌球蛋白的分析检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于制备elisa竞争法检测虾原肌球蛋白的试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体为包被抗体，抗体标记hrp后为酶标抗体，建立检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心elisa法，用此建立的双抗夹心法检测食品中虾原肌球蛋白，检测限为0.9ng/ml，具有实际应用价值。
本发明的第四个目的是提供制备所述虾原肌球蛋白单克隆细胞株的方法，是用虾原肌球蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述虾原肌球蛋白杂交瘤细胞株的制备方法基本步骤为：
(1)虾原肌球蛋白过敏原的制备：制备虾蛋白浸提液、饱和硫酸铵分级沉淀、sds-page鉴定虾原肌球蛋白、凝胶过滤层析分离得到高纯度蛋白。
(2)动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量虾原肌球蛋白加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用虾原肌球蛋白作为包被抗原，通过直接elisa法检测血清效价；
其具体elisa程序如下：
1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样：将抗血清从1:1000开始梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液(tmb与底物液体积比例1:5)，37℃避光反应15min；
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液(2mol/l的硫酸)终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450nm。
(3)细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和sp2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天用含20％胎牛血清、1％100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选：用虾原肌球蛋白作为包被抗原，用直接elisa进行检测，选取细胞团数少且阳性高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即得到能稳定分泌虾原肌球蛋白单克隆抗体的细胞株。
(4)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明还提供含有所述虾原肌球蛋白单克隆抗体的组合物。
本发明还提供用于虾原肌球蛋白检测的试剂盒，含有所述的单克隆抗体、固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液；所述用于包被所述固相载体的抗体为杂交瘤细胞cgmccno.14690分泌的单克隆抗体。
本发明的有益效果：本发明获得了能够分泌虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了检测虾原肌球蛋白的双抗体夹心elisa法，在检测食品过敏原中的应用，具有实际应用价值。
生物材料保藏
单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14690，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是本发明获得的虾原肌球蛋白检测曲线方程y＝0.22904+0.53319x(r2＝0.9937)的示意图。
具体实施方式
本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过直接elisa筛选细胞上清，将筛选得到的效价高的虾原肌球蛋白细胞株扩大培养，并经过腹水制备以及纯化，并用双抗体夹心法两两配对，最终建立了虾原肌球蛋白的双抗体夹心elisa检测方法。
实施例1虾原肌球蛋白的单克隆抗体制备
1、虾原肌球蛋白过敏原的制备：
a、虾蛋白浸提液制备：称取虾仁20g，组织捣碎机处理得虾肉泥。虾肉泥按1:10(w/v)浸入石油醚(60～90)中脱脂，4℃磁力搅拌下过夜，6000r/mim离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发得脱脂虾肉。随即按1:20(w/v)浸入0.05mph7.4pbs中浸提过夜，浸提液在4℃下以7000r/min离心20min，弃去沉淀，上清即为虾蛋白浸提液。
b、硫酸铵分级沉淀：在虾蛋白浸提液中缓慢加入饱和硫酸铵固体，边加边搅拌，直至饱和度为30％，4℃静置1h，8000r/min离心20min，收集沉淀复溶于0.05mph7.4pbs中，得30％饱和度组分。上清中继续加入饱和硫酸铵固体直至饱和度为50％，按上述30％饱和度组分获得方法得到50％饱和度组分。同样继续往上清中加入硫酸铵得到70％饱和度组分。上述三个分级组分别在0.05mph7.4pbs中透析24h。
c、sds-page鉴定：上述三个分级组分用紫外测定其蛋白含量(考马斯亮蓝法)，然后用sds-page鉴定各组分的蛋白成分。sds-page电泳条件为：10％分离胶，5％浓缩胶，恒压100v电泳80min。
d、凝胶过滤层析分离：通过sds-page鉴定后，挑选含有原肌球蛋白的硫酸铵沉淀组分进行凝胶过滤层析。层析柱为superdex7510/300gl凝胶过滤柱。层析条件：洗脱液为0.05mph7.4pbs，流速为0.35ml/min，2ml间隔自动收集，280nm紫外吸收监测。收集所需出峰样品，超纯水透析24h(4℃)。样品冷冻干燥后即为所制备的虾原肌球蛋白。
2、动物免疫：采用小剂量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg虾原肌球蛋白与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量虾原肌球蛋白加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用虾原肌球蛋白作为包被抗原，通过直接elisa法检测血清效价；
其具体elisa程序如下：
(1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
(3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
(4)加样：将抗血清从1:1000开始梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液(tmb与底物液体积比例1:5)，37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液(2mol/l的硫酸)终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450nm。
3、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
(2)收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
(3)将脾细胞和sp2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天用含20％胎牛血清、1％的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选：用虾原肌球蛋白作为包被抗原，用直接elisa进行检测，选取细胞团数少且阳性高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌虾原肌球蛋白单克隆抗体的细胞株。
5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
实施例2双抗体夹心elisa的建立：
1)包被：用浓度为4μg/ml的细胞株编号为fb12-1的抗体包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；
2)洗涤：用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反应板；
3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
4)洗涤：同2)；
5)样品：用pbs将虾原肌球蛋白稀释成1μg/ml，再三倍进行梯度稀释；另设一个pbs空白对照。每孔加入100μl样品，于37℃温育1h；
6)洗涤：同2)；
7)加酶标抗体(7h6-hrp，2μg/ml)，100μl/孔，37℃反应1h；
8)洗涤：同2)；
9)显色：加底物tmb100μl/孔，显色12min；
10)终止：加终止液50μl/孔；
11)测定：用酶标仪检测od450nm。结果图1所示，虾原肌球蛋白检测曲线方程为y＝0.2290+0.5332x(r2＝0.9937)，最低检测限为0.63ng/ml。
实施例3
以虾样品为例，检测其中的致敏成分虾原肌球蛋白
1)包被：用包被液将鼠抗虾原肌球蛋白单抗稀释至包被浓度，以100μl/孔加入酶标板中，4℃过夜；
2)洗涤：弃去酶标板孔内的液体，用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反应板；
3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
4)洗涤：同2)；
5)样品：用样品稀释液将虾原肌球蛋白作梯度稀释，待测样品作适当稀释，每孔100μl，设阳性对照和阴性对照，于37℃温育1h；
6)洗涤：同2)；
7)加入酶标抗体：将酶标记鼠抗虾原肌球蛋白抗体，稀释至工作浓度，100μl/孔，37℃反应1h；
8)洗涤：同2)；
9)显色：加底物tmb100μl/孔，显色12min；
10)终止：加终止液50μl/孔；
11)测定：用酶标仪检测od450nm。结果显示定量检测限为0.9ng/ml。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。