本发明属于微生物技术领域，具体涉及新的金黄色葡萄球菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是一种重要的人兽共患病原菌，广泛存在于自然界中，其侵染面广适应性强，可引起伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等多种疾病，造成的死亡率自11％至48％不等。甲氧西林敏感金葡菌(mssa)可被青霉素及甲氧西林杀灭，但如今美国过半的金黄色葡萄球菌对青霉素、甲氧西林、四环素和红霉素具有耐药性，其中耐甲氧西林金葡菌(mrsa)是医院中最普遍的病原菌，可耐受除新型先锋霉素外所有的β-内酰胺抗生素。此外，在20世纪90年代末出现了中等水平(4-8μg/ml)耐药性金葡菌，学名边缘型抗苯甲异噁唑青霉素葡萄球菌(borsa)。临床研究表明近年来由于耐药性金葡菌感染而导致的无法医治率迅速增加，造成每年大量患者死亡，对于金葡菌感染的治疗已经越来越困难，人类急需能够有效抑制金葡菌感染的新型治疗药物。
噬菌体是一种通过与细菌细胞表面特异位点结合后杀灭特异性细菌的病毒，在地球上广泛存在。自20世纪30年代巴斯德实验室(巴黎)提出将噬菌体疗法用于治疗细菌感染以来，越来越多的研究证明了噬菌体具有较高的抗菌活性和专一性，可防治耐药性细菌并防止损伤微生物群落。与抗生素治疗相比，其副作用极低且更加快速有效，不会抑制机体的自然免疫或引起变态反应，同时对人类或其他哺乳动物不具有侵染性及毒性。
然而，噬菌体在杀菌过程中也有其不利的因素。首先，噬菌体宿主特异性强，治疗的宿主谱相对较窄，单一的噬菌体往往极难满足临床治疗的需要，另外，相关研究表明，单一的噬菌体长时间与细菌接触，细菌可通过如吸附抑制、流产感染和溶原状态的建立等多种途径抵抗噬菌体的侵袭(harperdr，etal.bacteriophagetherapy：practicabilityandclinicalneedmeetinthemultidrug-resistanceera.futuremicrobiol，2012，7(7)：797-799.)。由多种噬菌体组成的鸡尾酒制剂不仅可大幅度扩展噬菌体的宿主范围，而且可以降低细菌对噬菌体产生的耐药性。
目前，大部分金黄色葡萄球菌噬菌体文献仅限于对单一噬菌体杀菌能力的研究(wang，z.f.，etal.，slpw：avirulentbacteriophagetargetingmethicillin-resistantstaphylococcusaureusinvitroandinvivo.frontiersinmicrobiology，2016.7：p.10.；jia，h.y.，etal.，characterizationandcompletegenomesequenceanalysisofstaphylococcusaureusbacteriophagejs01.virusgenes，2015.50(2)：p.345-348.江南大学，一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用，申请号cn201110380587)，而对于由几种噬菌体组成的鸡尾酒混合物的特性研究却鲜有报道。
技术实现要素：
针对以上技术现状，本发明提供了可裂解金黄色葡萄球菌的新型金黄色葡萄球菌噬菌体以及它们的组合物，本发明噬菌体具有较强的裂解金黄色葡萄球菌mrsa的能力。本发明所述金黄色葡萄球菌噬菌体为：
短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、保藏编号为cctccno：m2015142，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日；
金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)、保藏编号为cctccm2016535，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年9月28日；
短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)、保藏编号为cctccno：m2015143，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日；或
短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)、保藏编号为cctccno：m2015144保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年03月23日。
本发明中，作为实施方案之一，所述短科噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，且在ph5～ph9、在4℃～37℃条件下具有耐性，且moi＝0.01条件下培养6h，其效价可达到2.1×1010pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)具有等轴衣壳，可收缩性长尾以及尾部的末端六条短棘所组成的形态结构，且在ph5～ph9、在4℃～37℃条件下具有耐性，在moi＝0.1条件下培养6h，其效价为6.8×108pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，且在ph5～ph11、在4℃～37℃条件下具有耐性，且moi＝0.001条件下培养6h，其效价可达到5×1011pfu/ml；
本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)具有等轴衣壳以及可收缩性短尾组成的形态结构，在ph3～ph9、在4℃～37℃条件下具有耐性、moi＝0.01条件下培养6h，其效价为2.0×109pfu/ml。
本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)具有seqidno.1所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)具有seqidno.2所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)具有seqidno.3所示的核苷酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)具有seqidno.4所示的核苷酸序列。
短尾噬菌体bp-13的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌j1为宿主菌，于37℃下过夜培养，bp-13可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察bp-13噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-a)。bp-13噬菌体全基因组序列大小为18178bp，为双链线状dna。通过对其基因组序列blast比对发现，bp-13属于短尾噬菌体科(podoviridae)，基因组序列分析表明，bp-13噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。
金黄色葡萄球菌bp-13a的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌j1为宿主菌，于37℃下过夜培养，bp-13a可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察bp-13a噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为10nm(图1-b)。bp-13a噬菌体全基因组序列大小为136563bp，为双链线状dna。通过对其基因组序列blast比对发现，bp-13a属于肌尾噬菌体科(myoviridae)。基因组序列分析表明，bp-13a噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。
短尾噬菌体bp-14的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌j1为宿主菌，于37℃下过夜培养，bp-14可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察bp-14噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-c)。bp-14噬菌体全基因组序列大小为18137bp，为双链线状dna。通过对其基因组序列blast比对发现，bp-14属于短尾噬菌体科(podoviridae)，且与ncbi上已知噬菌体基因组的基因组序列并无完全相同者，这表明所述噬菌体是新种噬菌体；基因组序列分析表明，bp-14噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。
短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39的生物学特征：以多重耐药性金黄色葡萄球菌j1为宿主菌，于37℃下过夜培养，bp-39可形成平均直径为2～3mm的噬菌斑；在电子显微镜下观察bp-39噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为20nm，尾部长约为20nm(图1-d)。bp-39噬菌体全基因组序列大小为17641bp，为双链线状dna。通过对其基因组序列blast比对发现，bp-39属于短尾噬菌体科(podoviridae)。基因组序列分析表明，bp-39噬菌体全基因组无毒力基因或不良基因。
本发明还进一步提供了金黄色葡萄球菌噬菌体的组合物，作为实施方案之一，所述组合物含有短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)、短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)和短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)中的三种或四种组合。
作为实施方案之一，本发明所述三种或四种的组合物，可以是上述噬菌体中的短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp13-a)、短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)和短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39中任意三种的组合或是全部四种的组合，作为示例性的说明，如bp-13、bp-13a和bp-14的组合，bp-13、bp-13a和bp-39的组合，bp-13、bp-14和bp-39的组合，bp-13a、bp-14和bp-39的组合以及bp-13、bp-13a、bp-14和bp-39的组合。
本发明组合物中各噬菌体的量可以由本领域技术人员根据本发明公开内容及具体适用环境和本领域常识进行确定，作为实施方案之一，以单位体积中所含有各噬菌体的效价比计、所述bp-13、bp-13a和bp-14的比例为1∶1∶1，所述bp-13、bp-13a和bp-39的比例为1∶1∶1，所述bp-13、bp-14和bp-39的比例为1∶1∶1，所述bp-13a、bp-14和bp-39的比例为1∶1∶1，所述bp-13、bp-13a、bp-14和bp-39的比例为1∶1∶1∶1。
作为实施方案之一，本发明还提供一种含有上述噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒。本领域技术人员可以根据本发明公开内容和本领域常识来制备本发明含有上述噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
本发明提供一种上述的噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒在抗人源金黄色葡萄球菌(mrsa，mssa，borsa)或动物源金黄色葡萄球菌的应用。
作为实施方案之一，在无论使使用单一噬菌体或三种或四种噬菌体组合物进行细菌裂解时，所述噬菌体总有效工作效价为≥1×107pfu/ml。
作为实施方案之一，本发明还提供一种上述噬菌体、噬菌体组合物或含有噬菌体或噬菌体组合物的试剂或试剂盒用于制备治疗由金黄色葡萄球菌引发人类烫伤感染或是奶牛乳房炎等人畜疾病。
本发明中所述噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39，是从加拿大蒙特利尔污水处理厂中分离出的。
作为实施方案之一，所述方法包括：
将采集于加拿大蒙特利尔污水处理厂的噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39的来源样品，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用滤膜过滤上清液。
噬菌体的分离：分别取上述过滤后上清液，加入tsb培养基中，同时加入噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养、然后取上述培养物离心、滤膜过滤上清液，备用。取噬菌体宿主菌对数期菌液加入、半固体tsb培养基中混匀，倾倒于tsa平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。
噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至sm缓冲液中震荡，进行梯度稀释，取稀释液分别加入对数期宿主菌，混合均匀静置后，加入半固体tsb培养基，立刻倾倒于tsa平板上，摇匀平置待其凝固，置于37℃温箱培养，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至sm缓冲液中，按照上述方式纯化多次，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有对数期宿主菌菌液的tsb培养基中，37℃条件下摇培。取培养物离心、滤膜过滤上清液，即为得到的纯化噬菌体溶液。
实验证明：本发明所述的金黄色葡萄球菌噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39所组成的噬菌体组合物对135株人源金黄色葡萄球菌的裂解率可达97％，对44株牛源金黄色葡萄球菌的裂解率可达100％。
与现有技术相比，本发明所述的噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39具有的优势包括：为严格的烈性噬菌体并可有效杀灭包括金黄色葡萄球菌；在较低浓度下对宿主菌依然具有较好的裂解能力；对正常微生物菌群无毒害作用；其dna无法编码毒力基因；特别是，本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的4株噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39可治疗或预防由金黄色葡萄球菌引起的细菌感染，为开发新型抗菌制剂提供了优良的菌种资源，具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1：实施1中所得的4株噬菌体透射电子显微镜下的形态特征。
短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015142；
金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号cctccm2016535；
短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015143；
短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日、保藏编号cctccno：m2015144。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，
tsb液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml；
tsa固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml；
tsb半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000ml；
sm液配方为.氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/ltrishcl50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。
实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养
本发明中短尾噬菌体bp-13，金黄色葡萄球菌bp-13a，短尾噬菌体bp-14以及短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39的来源样品采集于加拿大蒙特利尔污水处理厂，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。
噬菌体的分离：取10ml过滤后上清液，加入10ml2倍tsb培养基中，同时加入1ml噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养16h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5ml噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5ml，40℃半固体tsb培养基中混匀，倾倒于tsa平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养16h，形成噬菌体点滴斑。
噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mlsm缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取102，104和106稀释液分别加入对数期宿主菌0.5ml，混合均匀静置15min后，加入5ml，40℃半固体tsb培养基，立刻倾倒于tsa平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养16h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mlsm缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1ml对数期宿主菌菌液的50mltsb培养基中，37℃条件下180rpm摇培16h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)、保藏编号为cctccno：m2015142，金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)、保藏编号为cctccno：m2016535，短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)、保藏编号为cctccno：m2015143，或短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)、保藏编号为cctccno：m2015144。
实施例2：噬菌体的电镜观察
分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μl样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(pta)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，bp-13噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-a)；bp-13a噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为100nm，尾部长约为10nm，尾部的末端具有六条短棘(图1-b)；bp-14噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为150nm，尾部长约为10nm(图1-c)；bp-39噬菌体形态发现，其具有呈正多面体的头部结构和较短的尾部，头部直径约为20nm，尾部长约为20nm(图1-d)。
实施例3：噬菌体基因组的提取与测序
分别取实施例1制得的各噬菌体100ml，加入终浓度1μg/ml的dnasei，rnasea，37℃条件孵育60min后加入5.84gnacl(终浓度1mol/l)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体peg8000(终浓度10％，即100ml加入10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量sm液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入dnasei、rnasea至终浓度1μg/ml，37℃反应30～60min。加入edta至终浓度20mmol/l(即1mlsm液加入40μl0.5mol/ledta)，同时每1mlsm液中加入10μl10％sds。从加入蛋白酶步骤开始，使用dp315-rtianampvirusrnakit病毒rna提取试剂盒(tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证dna后用eppendorfbiophotometerplus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
短尾噬菌体bp-13(podoviridaesp.bp-13)具有seqidno.1所示的核苷酸序列；
金黄色葡萄球菌bp-13a(staphylococcusaureusphagebp-13a)具有seqidno.2所示的核苷酸序列；
短尾噬菌体bp-14(podoviridaesp.bp-14)具有seqidno.3所示的核苷酸序列；
短尾噬菌体ahjd样噬菌体属bp-39(podoviridaepicovirinaeahjdlikevirusbp-39)具有seqidno.4所示的核苷酸序列。
实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本专利选取44种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明4株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。
表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例5：噬菌体moi及效价的测定
挑取金黄色葡萄球菌j1单个菌落，接种到盛有3mltsb培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mltsb培养液，37℃160rprn振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体4种噬菌体纯培养液和宿主菌(moi＝噬菌体数量/细菌数量)，加入tsb液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用sm液做稀释液，将噬菌体bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39原液(由实施例1制得)分别10倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μl与其宿主菌多重耐药性金黄色葡萄球菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的moi为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
结果表明，培养6h条件下，噬菌体bp-13效价达到最高(2.1×1010pfu/ml)时，其moi＝0.01；噬菌体bp-13a效价达到最高(6.8×108pfu/ml)时，其moi＝0.1；噬菌体bp-14效价于6h内达到最高(5×1011pfu/ml)，其moi＝0.001；噬菌体bp-39效价达到最高(2.0×109pfu/ml)时，其moi＝0.01。
表24株噬菌体moi值
实施例6制备噬菌体鸡尾酒组合物
将实施例5富集得到的噬菌体溶液分装至50ml离心管中，每管40ml；加入固体peg8000(终浓度10％，即40ml加入4g)，完全溶解后，冰浴至少3h；将噬菌体4℃，12000rpm离心20min；弃去上清液，使用等体积的sm缓冲液充分溶解沉淀；将噬菌体sm洗脱液使用0.22μm滤膜，过滤除菌。检测效价后，根据表3中的要求分别将噬菌体进行稀释混合。最终获得的鸡尾酒混合液总效价均为1.2×107pfu/ml，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等。
表3不同的噬菌体组合物及比例
实施例7：噬菌体及噬菌体鸡尾酒组合物ph和温度稳定性的测定
7-1：不同ph条件下噬菌体的稳定性
将效价为1.2×107pfu/mlbp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体，以及总效价为1.2×107pfu/ml的噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39(由实施例6制得)分别置于ph＝3，5，7，9，11的sm溶液中，4℃培养24h后，再检测其效价。
结果如表4所示，在ph＝5～ph＝9之间，4株噬菌体的效价均无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。
在ph＝3条件下，4株噬菌体仅有bp-39仍具有3次方左右的效价，但是相比中性条件也下降了4个数量级，表明噬菌体bp-39与其余噬菌体相比具有一定的抗酸能力；
在ph＝11条件下，4株噬菌体仅有bp-14仍具有4次方左右的效价，但是相比中性条件也下降了3个数量级，表明噬菌体bp-14与其余噬菌体相比具有一定的抗碱能力。
由bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体中的任意3种或是全部4种组成的鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39在ph＝5～ph＝9之间，效价均无显著变化，表明上述4种鸡尾酒混合物在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。
含有bp-39的鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39在ph＝3的条件下仍有3次方左右的效价，
而含有bp-14的鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-14+bp-3，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39在ph＝11条件下仍有4次方左右的效价。表明，bp-39和bp-14可以有效扩展噬菌体鸡尾酒混合物的ph适应范围。
表44株单一噬菌体及其鸡尾酒混合物在不同ph条件下的稳定性
7-2：不同温度条件下噬菌体的稳定性
将效价为1.2×107pfu/mlbp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体，以及总效价为1.2×107pfu/ml的噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39(由实施例6制得)分别置于4℃，25℃以及37℃条件下，检测其效价。
结果表明(参见表5～7)，在4℃条件下，bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39都具有较好的稳定性，存放3个月后，效价并无明显下降，存放12个月后，效价均大约仅仅下降一个数量级；在25℃条件下，bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39在一周之内效价无明显下降，4周后，效价均大约仅仅下降1个数量级；在37℃条件下，bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39等4种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39在24小时内效价没有明显下降，72小时后，效价均大约仅仅下降1个数量级。由此表明，由上述4种噬菌体组成的鸡尾酒混合物在不同温度条件下都具有较好的稳定性。
表54株噬菌体及其鸡尾酒混合物在4℃条件下的稳定性
表64株噬菌体及其鸡尾酒混合物在25℃条件下的稳定性
表74株噬菌体及其鸡尾酒混合物在37℃条件下的稳定性
实施例8人源耐药性金黄色葡萄球菌裂解范围试验
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取临床分离所得的31株甲氧西林敏感金葡菌(mssa)、97株耐甲氧西林金葡菌(mrsa)及5株边缘型抗苯甲异噁唑青霉素金葡菌(borsa)的单菌落，将其接种于盛有3mltsb的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
结果如表8所示，bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达67.66％，78.51％，63.99％和64.66％。
其噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39的裂解率分别为97.74％，89.47％，88.72％，97.74％和97.78％。由此表明，采用上述4种噬菌体的鸡尾酒混合物对人源金黄色葡萄球菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。
表8噬菌体对人源金黄色葡萄球菌裂解谱的测定结果
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例9动物源金黄色葡萄球菌裂解范围试验
采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取44株动物源金黄色葡萄菌的单菌落，将其接种于盛有3mltsb的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上。加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表9所示，bp-13，bp-13a，bp-14及bp-39具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达61.36％，84.1％，50％和65.9％。其噬菌体鸡尾酒混合物bp-13+bp-13a+bp-14，bp-13+bp-13a+bp-39，bp-13+bp-14+bp-39，bp-13a+bp-14+bp-39以及bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39的裂解率分别为100％，100％，65.9％，100％和100％。由此表明，采用上述4种噬菌体的鸡尾酒混合物除了bp-13+bp-14+bp-39的组合外，对动物源金黄色葡萄球菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。
表9动物源葡萄球菌的裂解谱的测定结果
注：可分为“+++”无全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例10：噬菌体对非致病性大肠杆菌的裂解试验
挑取10株非致病性大肠杆菌菌落分别接种于盛有3mltsb的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果如表10所示，在本研究中，4株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别10株供试大肠杆菌。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表104株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非致病性大肠杆菌的裂解试验
注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”
实施例11：噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验
挑取30株非宿主性病原细菌单菌落，包括停乳链球菌5株，无乳链球菌5株，副溶血弧菌5株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌5株，鲍曼不动杆菌5株。分别接种于盛有3mltsb的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，4株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别30株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表11)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表114株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非宿主性致病性细菌的裂解试验
(注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”)
实施例12：噬菌体对金黄色葡萄球菌的抑菌效果试验
取装有50ml无菌tsb培养基的锥形瓶10个，编号分别为1-10号；10瓶培养基中，分别接种处于对数期的细菌(来源于浙江省某医院的人类烧伤感染致病金黄色葡萄球菌zj-42或山东省某奶牛场的奶牛乳房炎致病金黄色葡萄球菌sdn-12)100μl；1号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13，2号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp13-a，3号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-14，4号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-39，5号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13+bp-13a+bp-14混合液，6号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13+bp-13a+bp-39混合液，7号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13+bp-14+bp-39混合液，8号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13a+bp-14+bp-39混合液，9号加入终浓度为1.2×107pfu/ml的bp-13+bp-13a+bp-14+bp-39混合液，10号加入和以上噬菌体等体积的sm缓冲液。放置于37℃培养箱中作用。分别于0h，3h，6h，24h，48h和96h取出2ml，检测其od600数值。
结果显示，4株噬菌体单独对zj-42在24h之内都有明显的抑制效果，而24小时之后抑制效果明显下降，而4株噬菌体的鸡尾酒混合物则在48小时之内对zj-42有明显的抑制作用，效果明显优于单株噬菌体；4株噬菌体对奶牛乳房炎致病菌sdn-12则是在48小时之内有明显的抑制作用，48小时之后，抑制效果明显下降，而4株噬菌体的鸡尾酒混合物则在96小时之内对sdn-12仍有明显的抑制作用。由此表明，鸡尾酒混合物的抑菌效果要明显优于单株噬菌体。具体参见表12～13
表124株噬菌体对烧伤感染金黄色葡萄球菌zj-42的抑菌效果
表134株噬菌体对奶牛乳房炎致病金黄色葡萄球菌sdn-12的抑菌效果
序列表
<110>菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
<120>新型金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物和应用
<130>lac161272p
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