本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种长尾宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体及其在养殖环境中的应用。
背景技术：
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的急性系统性疾病，危害养鸡业最严重的细菌性传染病之一，主要经卵垂直传播，亦可经消化道，呼吸道感染。蛋内感染鸡白痢者，多表现死胚或弱胚，不能出壳或出壳后死亡，一般无特殊的临床症状。雏鸡感染一般呈急性经过，发病高峰在7～10日龄，常见的临床症状有三型：急性败血型、关节炎型和神经型。临床症状多为排稀薄白色浆糊状粪便，出现糊肛现象，病雏多因呼吸困难及心力衰竭而死。2～3周龄的雏鸡感染死亡率较高，4周龄以上鸡感染鸡白痢一般较少死亡，成鸡以局部或慢性感染、隐性感染为主，母鸡表现产蛋量下降，感染后死亡率较低，但可长期带菌排菌。
目前临床防治鸡白痢的主要方法为定期检疫，净化种鸡群，全进全出和自繁自养的管理措施及生产模式。由于沙门氏菌病可呈水平传播和垂直传播，上述预防作用并不理想，目前多数养殖场以药物预防为主，大量抗生素预防导致细菌耐药性问题严重，继控制沙门氏菌污染成为世界性难题后，沙门菌耐药性问题也已经是一个全球性的问题。因此，研究开发无污染、无残留、安全、可替代抗生素的新型产品解决沙门氏菌污染问题，引起各界广泛关注。
噬菌体自然界分布广泛，制备工艺简单，研发周期短，不易产生耐药性，成本低廉。噬菌体具有很强的特异性，一般只感染特定种属的病原菌，不会破坏正常菌群；噬菌体的增殖能力也非常强，作为治疗制剂使用能不断扩大作用疗效，目前的研究还没有发现噬菌体治疗会引起严重副反应，也没有噬菌体口服过敏现象的报道。最重要的是噬菌体治疗不受细菌耐药性的限制，噬菌体具有完全不同于抗生素的杀菌机制，不受到细菌已经获得的抗生素耐药性的影响。噬菌体只在细菌感染的部位发生作用，随着病原菌的死亡而减少，直至消失，不会造成二次污染。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供一种长尾宽宿主谱的鸡白痢沙门氏菌噬菌体。
本发明的另一目的是：针对目前养殖业中鸡白痢沙门氏菌疾病提供一种有效防治的产品，本发明提供一种长尾宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，开发一种对鸡白痢沙门氏菌具有强裂解性的噬菌体制剂，该制剂可以单独或鸡尾酒使用。为鸡白痢沙门氏菌感染的治疗提供一种安全、无毒副及无残留作用的噬菌体产品，为工业化生产噬菌体制剂提供噬菌体来源。
本发明的又一目的是：提供一种无污染、无残留的环保有效的防治手段，将所述的噬菌体sp4制备成液体、冻干粉，单独或配合其他噬菌体，经口服、喷雾等方式，用于杀灭动物体内外、养殖空间环境中的沙门氏菌。
本发明的目的是这样实现的：一种长尾宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，其特征在于：保藏号为cgmccno.14332，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月27日，该噬菌体命名为sp4，其对鸡源沙门氏菌、猪源沙门氏菌、鸭源沙门氏菌、貂源沙门氏菌以及食品源沙门氏菌均有裂解活性。
该噬菌体具有呈多面体的头部结构和无收缩性的尾部，头部直径约53nm，尾部长约108nm；噬菌体在双层琼脂培养基平板上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约2～3mm；该噬菌体应属于长尾噬菌体科。
在本发明中：所述的噬菌体在40～50℃中放置60min，其活性稳定，在80℃中放置20min，效价降低约2个数量级，在70～80℃中放置60min则失活；在ph为6～9时，活性稳定。
一种上述噬菌体的应用，其特征纯化后的噬菌体能够裂解鸡白痢沙门氏菌，对所收集的24株鸡白痢沙门氏菌中的23株有裂解作用，裂解率为95.83％。
一种上述噬菌体的应用，其特征纯化后的噬菌体能够裂解不同宿主来源的沙门氏菌。噬菌体sp4对104株(猪源28株、鸭源11株、水貂源14株、鸡源46株、食品源5株)沙门氏菌中的64株菌具有裂解作用，猪源28株，裂解6株，裂解率为21.43％；鸡源46株，裂解41株，裂解率达到89.13％；鸭源11株，裂解9株，裂解率为81.81％；水貂源14株，裂解7株，裂解率为50％；食品源5株，裂解1株，裂解率为20％；对46株鸡源沙门氏菌中24株鸡白痢沙门氏菌可裂解23株，裂解率高达95.83％。。
在所述的噬菌体的应用中，其特征在于：在感染鸡白痢沙门氏菌雏鸡中应用此噬菌体，2周内可以减少60％的死亡率。
在所述噬菌体的应用中，还可以用于猪沙门氏菌、鸭沙门氏菌、水貂沙门氏菌以及食品源沙门氏菌感染的控制。
在所述的噬菌体的应用中，其特征在于：将纯化后的噬菌体制备成液体、冻干粉形式，单独或与其他噬菌体、抗生素复配后通过口服或喷雾等途径用于不同来源沙门氏菌感染的控制。
本发明的优点在于：分离到的鸡白痢沙门氏菌噬菌体对鸡源沙门氏菌、猪源沙门氏菌、鸭源沙门氏菌、水貂源沙门氏菌以及食品源沙门氏菌均有裂解活性，是一种宽宿主谱的噬菌体。是一种新型环保的防治禽沙门氏菌疾病的产品和手段。经雏鸡安全性试验证明，该噬菌体无毒副作用，安全性高，在发病试验中服用本噬菌体组明显降低了雏鸡死亡率。
附图说明
图1为sp4噬菌体的电镜图片。
图2为sp4噬菌斑图片。
图3为sp4噬菌体酶切图谱图片。其中，m：dl2000dnamaker；1sp4核酸+rnasea；2sp4核酸+dnaseⅰ；3sp4核酸；4sp4核酸+bal31。
图4为sp4噬菌体的热稳定性。
图5为sp4噬菌体的ph值稳定性。
图6为sp4噬菌体的一步生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体的实施来进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明，而不是用来限制本发明的范围。下述实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1噬菌体sp4的分离制备
本发明中的粪液污水样品采自山东省某鸡场；
宿主菌为鸡白痢沙门氏菌cvcc533。
1、宿主菌cvcc533的复苏培养与增值液制备
挑取宿主菌cvcc533的菌液，在ss琼脂培养基上三区划线，37℃的恒温箱中培养16～24h，得到单菌落。挑取单菌落，接种于5ml的lb肉汤试管中，37℃，170rpm振荡培养过夜，得到增殖液。
2、粪液污水样品处理
取50ml鸡场的粪液污水，加入500μl宿主菌cvcc533，再加入lb培养基至200ml，37℃浸泡孵育过夜。次日，取出5ml的液体，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体原液，置于4℃保存。
3、噬菌体的分离
利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液10倍稀释，取10-2和10-4稀释液各取100μl与200μl宿主菌cvcc533增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约50℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养6～8h后，获得形成噬菌斑的双层平板。
实施例2噬菌体的增殖和纯化
1、噬菌体的增殖
在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1ml的lb肉汤中，置于40℃水浴锅中孵育30min，得到噬菌体浸出液。取200μl噬菌体浸出液与200μl宿主菌增殖液于5ml液体lb培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体10000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。
2、噬菌体的纯化
取噬菌体增殖液100μl与200μl宿主菌cvcc533增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约50℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养6～8h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1ml的lb肉汤中，置于40℃水浴锅中孵育30min，得到噬菌体浸出液。取200μl噬菌体浸出液与200μl宿主菌增殖液于5ml液体lb培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体10000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。如此循环3次，得到纯化后的噬菌体悬液。
实施例3噬菌体的生物学特性
1、噬菌体sp4的形态学特性
噬菌体sp4在透射电镜下观察(见图1)。该噬菌体头部呈多面体结构，有细长的尾部，噬菌体头部长径约55nm，横径约53nm，尾部约108nm。根据噬菌体分类，本研究噬菌体形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体。
2、噬菌体sp4培养特性
噬菌体sp4在双层琼脂培养基平板上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约2-3mm(见图2)。
3、噬菌体sp4基因组核酸类型鉴定
将大规模增殖的噬菌体sp4用peg-nacl法浓缩后，使用病毒基因组dna/rna提取试剂盒对噬菌体核酸进行提取，取5μlsp4噬菌体核酸分别与5μldnaseⅰ、5μlrnasea以及5μlbal31核酸酶和25μlbal31buffer混合,将混合物置于37℃温箱中作用1h，取作用之后的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。根据酶切图谱(见图3)分析得出，该噬菌体sp4核酸是双链dna分子(dsdna)。
实施例4温度及ph对噬菌体sp4的影响
各取100μl噬菌体sp4增殖液(效价为3.8×1010pfu/ml)分装于无菌ep管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，通过10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体sp4热稳定性曲线。
以实施例4的噬菌体sp4为基础，于无菌试管加入不同ph值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的lb肉汤4.5ml，然后将上述试管置于37℃的水浴锅中，待温度平衡后各加入500μl噬菌体增殖液混匀后，37℃水浴作用1h、2h和3h。每管样品采用双层平板法测定噬菌体效价，并且每个ph值设定2个重复。以ph值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体ph值稳定性曲线。
热稳定性结果发现(图4)，噬菌体sp4在40℃～50℃作用60min后依然保持较高活性，在60℃作用1h后效价下降5个滴度，在70℃～80℃作用60min时完全失活。说明本发明噬菌体的热稳定性较好，能够在饮水或饲料中添加使用。
如图5所示，噬菌体sp4在ph6～9范围内3h后保持原有效价；在ph2～5、ph10～13范围内作用3h后均有活性，在ph6～9噬菌体更稳定。
实施例5噬菌体sp4的一步生长曲线
以实施例4的噬菌体sp4为基础，将感染复数为10的噬菌体sp4增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1ml，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mllb肉汤洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的lb肉汤混悬沉淀(总体积为5ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μl，10000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体sp4的潜伏期、爆发期。
通过图6噬菌体sp4一步生长曲线发现，噬菌体感染宿主菌后，在15min内效价基本不变，效价稳定在105pfu/ml，表明噬菌体sp4潜伏期约为15min，噬菌体侵染宿主菌后的10～60min内，噬菌体数量急剧增加，在60min时效价增长开始趋于平稳，此时效价可达1010pfu/ml，可见噬菌体sp4的爆发期约为50min，爆发量为70。
实施例6噬菌体sp4的体外裂解效率
用无菌接种环挑取于-20℃保存的宿主菌的菌液，在ss琼脂培养基上三区划线，37℃的恒温箱中培养16～24h，得到单菌落。用灭菌的白色枪头挑取复苏培养的单菌落，接种盛有5ml的lb肉汤的试管中，37℃，170rpm震荡培养16h，得到单一的宿主菌悬液。调整宿主菌浓度为1×105cfu/ml，取1ml，分别用109，108，107，106，105pfu/ml的噬菌体sp41ml与之混合，室温放置30min，同时设与1ml的sm液混合的对照处理。轻微混匀后，将液体稀释10-1，10-2，10-3，10-4，每个梯度取100μl至普通平板，用无菌涂布棒涂布均匀，倒置培养16～24h，每个做3个平行。进行平板菌落数计数。
噬菌体裂解效率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％
通过噬菌体sp4体外裂解效率测定发现，噬菌体浓度≥108pfu/ml，对宿主菌完全裂解，噬菌体浓度≤107pfu/ml时裂解率逐渐下降。
实施例7噬菌体裂解谱的分析
以实施例4的噬菌体sp4为基础，采用单斑法测定噬菌体的裂解谱：取1ml新鲜噬菌体sp4增殖液，10000rpm离心10min沉降细菌碎片。初步选择噬菌体原液进行试验。分别挑取实验室保存的104株不同来源沙门氏菌在ss板划线培养得到单菌落，挑取单菌落分别接种于5ml营养肉汤中，37℃，170rpm培养12h，得到各株细菌菌液，取100μl细菌菌液分别均匀涂布在普通琼脂平板上，待干燥后，取1μlsp4的噬菌体增殖液滴于平板上，待自然干燥后37℃培养8～12h，观察结果。
通过裂解谱测定实验发现，试验选用的细菌菌液在平板上生长良好，噬菌体sp4对104株(猪源28株、鸭源11株、水貂源14株、鸡源46株、食品源5株)沙门氏菌中的64株菌具有裂解作用，猪源28株，裂解6株，裂解率为21.43％；鸡源46株，裂解41株，裂解率达到89.13％；鸭源11株，裂解9株，裂解率为81.81％；水貂源14株，裂解7株，裂解率为50％；食品源5株，裂解1株，裂解率为20％。其中对46株鸡源沙门氏菌中24株鸡白痢沙门氏菌可裂解23株，裂解率高达95.83％。说明噬菌体sp4有较宽的裂解谱，可用于不同来源的沙门氏菌感染的控制。
实施例8噬菌体的安全性试验
选择20只1日龄spf雏鸡，购自青岛某种鸡场，随机分成实验组和空白对照组2组，试验组灌服噬菌体sp4增殖液1×1010pfu/ml/0.25ml/只，试验组灌服等体积无菌生理盐水，连续服7d，观察小鸡的行为表现及其生长情况，7d后每组剖检5只小鸡，观察内脏和消化道及黏膜变化情况。
结果发现试验组和对照组小鸡生长情况一致，无不良反应，两组剖检的鸡内脏、消化道黏膜等未见异常，从而确定噬菌体sp4安全无毒副作用。
实施例9噬菌体sp4的雏鸡治疗试验
选择120只健康的1日龄的雏鸡，分为3组，对照组、感染组、治疗组，每组40只。按以下方式建立感染，挑取鸡白痢沙门氏菌cvcc533单克隆于5mllb培养基中，培养24h，调整其浓度为1×108cfu/ml。对照组不攻菌，感染组每只小鸡口服100μl，治疗组在口服细菌的同时口服噬菌体sp4，感染组口服等体积pbs，连续灌服5天，后期正常饲养14天，观察各组小鸡死亡情况，计算死亡率。
结果显示，对照组雏鸡全部成活，感染组雏鸡死亡率100％，治疗组雏鸡死亡率40％，可知感染鸡白痢沙门氏菌的雏鸡服用噬菌体sp4可以减少60％的死亡率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。