本发明涉及一株稳定表达抗pedv中和抗体的cho细胞系及其构建方法和应用，特别涉及一株稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系及其构建方法和应用。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)是引起仔猪腹泻的主要病原之一，以水样腹泻、仔猪高发病率和高死亡率为主要特征，每年给我国养殖业造成重大经济损失。疫苗接种是预防pedv腹泻发病的主要手段。但是，由于pedv变异毒株不断出现等原因，常常导致传统的疫苗不能完全保护而免疫效果欠佳，因此，猪基因工程单克隆抗体治疗性制剂作为安全高效防控(治)产品成为家畜腹泻性疾病防治的重要补充。
pedv经消化道感染猪，主要感染小肠上皮细胞，局部肠道黏膜免疫在抗pedv感染中发挥了重要作用，特别是pedv特异性的iga。由于pedv主要造成新生仔猪的大量死亡，而新生仔猪免疫系统发育不完全，一旦发病，主动免疫接种来不及，开发有效的猪源igapedv治疗性抗体等防治制剂对减少养猪业经济损失非常重要。
cho细胞表达系统因其分泌内源性蛋白少，翻译后能够进行糖基化修饰和表达量高成为当今治疗性抗体主要生产系统。猪流行腹泻病毒是引起仔猪腹泻的主要病原，每年给我国养殖业造成巨大的经济损失。机体抵抗pedv感染主要通过产生保护性抗体，特别是黏膜免疫的iga抗体。而猪iga的生产和纯化不容易建立。至今还没有稳定表达猪源抗pedviga抗体和特异性亲和层析纯化猪iga方法的报道。
本发明筛选获得了一株稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系，该细胞系能够持续分泌表达全猪源的pc10-iga抗体，表达的抗体pc10-iga具有结合pedv病毒蛋白和抗pedv的中和活性，本发明的提出为进一步研发全猪源的pc10-iga抗体制剂提供了技术手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一株稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系及其构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明利用前期分离到一株猪源抗pedv的pc10单克隆抗体，通过体外构建pc10-iga重链和轻链表达质粒，通过共转重链和轻链至cho细胞，利用单个细胞流式分选和g418加压筛选，获得一株稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系。该细胞上清分泌表达的pc10-iga抗体具有中和pedv病毒的能力，同时可以与感染vero-e6细胞的病毒蛋白结合，因此具有生物学活性和抗pedv功能。
所述的一株稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系，命名为pc10-iga-cho，分类命名为稳定表达全猪源抗猪流行性腹泻病毒(pedv)中和抗体pc10-iga的cho细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmccno.15293，保藏日期为2018年1月29日。
进一步的，本发明还提出了一种全猪源抗pedv的中和抗体pc10-iga，所述的中和抗体由所述的cho细胞系分泌产生。
更进一步的，本发明还提出了所述的cho细胞系及其分泌的中和抗体pc10-iga在制备pedv防治制剂中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系，通过对该细胞系进行培养，即可获得大量的具有抗pedv作用的pc10-iga中和抗体，本发明的提出使治疗性抗pedviga抗体大量的获得和使用成为了可能，为pedv的预防和治疗提供了新的技术手段。
附图说明
图1为pc10-iga的elisa检测结果；
其中，a：细胞上清分泌iga的情况；b：与pedv的结合情况；
图2为pc10-iga稳定表达cho细胞的pcr和rt-pcr分析结果；
图3为去除g418后pc10-iga的elisa检测结果；
图4为细胞形态图；
其中：a:3天的细胞形态；b:5天的细胞形态；
图5为稳定表达pc10-iga的elisa检测结果；
图6为pc10-iga的ifa中和实验结果(a)及其上清的pedv荧光定量结果(b)；
图7为pc10-iga与pedv感染细胞结合的ifa结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将更为明显。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞系的构建1材料：
cho细胞系和pedvcv777株由本实验室保存；pcdna3.1(-)质粒和lipofectmine2000购自invitrogen公司；g418由genview分装，购自鼎国生物技术有限责任公司；imem培养基和胎牛血清购自gibco公司。
2、方法：
2.1表达全猪源抗体pc10-iga的重轻链vh和vk的真核细胞表达质粒pcdna3.1(-)pc10-vh和pcdna3.1(-)pc10-vk的构建：
分别用iga重、轻链的恒定区替换文献(fangfu,linli,linglingshan,beibeiyang,hongyanshi,jiaoerzhang,hongfengwang,lifeng,pinghuangliu.aspike-specificwhole-porcineantibodyisolatedfromaporcinebcellneutralizespedv.vetmicrobiol.205(2017)99–105)中的pc10-igg1的igg重、轻链的恒定区，使用以下引物扩增iga重、轻链的全长：
cmvf262：5‘-agtaatcaattacggggtcattagttcatag-3’
bghr1235：5‘-tccccagcatgcctgctattgtc-3’
得到的全长产物克隆到真核表达载体pcdna3.1(-)上，获得的质粒命名为pcdna3.1(-)pc10-vh和pcdna3.1(-)pc10-vk。
2.2、转染和稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga单克隆细胞株cho的筛选：
以含10％胎牛血清的imem培养液培养cho细胞。转染的前一天胰酶消化细胞，进行细胞计数。将1.5×105个细胞接种到24孔板中。质粒pcdna3.1(-)pc10-vh和pcdna3.1(-)pc10-vk经内切酶nhei切开成线性，以作稳定转染。分别用50μl的无血清opti培养基稀释重、轻质粒各0.6μg和4.5μllipofectmine2000，室温孵育5min后，将lipofectmine2000加入质粒中，总体积为100μl，轻轻混匀，室温孵育20min后，将混合物加到24孔板。
转染6h后细胞换液，24h后加入含g418(浓度为800μg/ml)的培养液筛选，10d后细胞成簇状生长，为了获得稳定表达全猪源抗pedv中和抗体pc10-iga的cho细胞，通过流式分选将加压后的单个细胞接种至96孔板培养。置于5％co2培养箱中37℃培养7-10d。在光学显微镜下对培养的细胞板观察，标志出只有单个细胞克隆的孔，取其上清并通过间接elisa检测iga，筛选出分泌pedviga的阳性克隆。将克隆转移至细胞培养瓶中继续扩大培养，期间g418维持浓度为400μg/ml。
间接elisa操作步骤如下：
用0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液分别稀释pedv病毒(包被浓度104tcid50/孔)和鼠抗猪iga(bio-rad，货号mca638ga，0.1mg，1000倍稀释)，然后分别包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。用封闭液(含5％的脱脂乳和5％的小牛胎牛血清的pbs)封闭2h，然后分别加入细胞培养上清，37℃作用1h后取出洗涤，加入酶标二抗(羊抗猪iga-hrp标记，货号270415。pedv包被的二抗使用浓度为1000倍稀释；鼠抗猪iga包被的二抗使用浓度为10000倍稀释)，1.5h后取出洗涤，然后加入tmb(amiresco)显色，37℃避光反应20min后，用2mol/lh2so4终止反应。酶标仪测定od450值。同时设标准阳性血清(p)、标准阴性血清(n)。
2.3、逐步减少g418后表达水平检测：
细胞在800μg/ml的g418抗性培养基中培养2个月后，将g418浓度逐步降低直至为0，每种浓度各维持10d左右，收获细胞上清并检测其表达情况。
2.4、阳性pc10-iga-cho细胞系的培养及传代：
pc10-iga-cho细胞采用imem培养基，包含15％胎牛血清、100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素于37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至100％时传代。传代前收获培养瓶内的培养基，pbs洗涤细胞2次，弃去pbs，加入适量0.25％胰酶37℃放置3～5min消化细胞，显微镜下观察，待到绝大部分细胞变圆即加入培养基终止消化，吹吸若干次使细胞成离散状态后按需传代。
2.5、pcr和rt-pcr方法检测pc10-iga-cho细胞系的dna和mrna表达水平：
应用dna和mrna试剂盒提取转染细胞株总dna和总mrna，后者经逆转录反应后获得相应的cdna。
重链引物序列为：
cmvseq-f：5’-gaacaccaagaatcgatggaca-3’，
piga-hxhoirev：5’-ccgctcgagttagtagcagatgccctc-3’；
轻链引物序列为：
cmvseq-f：5’-gaacaccaagaatcgatggaca-3’，
pigk-lxhoirev：5’-ccgctcgagctaagcctcacactcgttc-3’
pcr反应体系为：灭菌水14.75μl，反应缓冲液(5×)5μl，dntp(2.5mmol·l-1)2μl，primestar酶0.25μl，上下游引物(10μmol·l-1，重链和轻链)各1μl，模板1μl。pcr反应条件均为：pcr程序为：94℃2min，98℃10s、50℃5s、72℃90s，30个循环；72℃5min将扩增所得pcr产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定是否有dna和mrna表达。
2.6、细胞上清的检测试验：
采用已建立的间接elisa方法，对细胞培养上清进行收集，每隔48h进行一次收集(2000g，4℃，15min离心)。对收集上清进行了iga(2000倍稀释)抗体检测，同时利用纯化猪分泌性iga建立的标准曲线，计算iga的表达量；根据不同时间分泌的iga的od值和表达浓度绘制iga的分泌曲线。
2.7、pedv病毒抑制实验：
取160μlpc10-iga-cho细胞系培养上清，与80μlpedvcv7773-18(400tcid50/ml，含3μl/ml0.25％胰酶，1％sp)混合，37℃孵育1h。用无血清dmem洗细胞(96孔板)，加入上述混合液体，37℃孵育2h，细胞洗2次，加入3％fbs的dmem营养液继续培养。36h后，分别收取细胞培养上清和细胞通过荧光定量rt-pcr和间接免疫荧光(ifa)检测pedv。对于荧光定量rt-pcr，从培养上清提取rna和反转录，应用sybrtmgreen荧光定量试剂盒(invitrogen，货号1705548)对样品进行pedv绝对定量的检测；细胞洗涤后用4％多聚甲醛固定后，进行pedvifa检测。
2.8、pedv病毒结合实验：
1)细胞板的处理：将pedv病毒稀释至400tcid50接种96孔板中处于对数生长期的vero-e6细胞，37℃孵育2h，洗细胞2次，加入3％fbs的dmem营养液继续培养。感染36h后，首先将细胞用多聚甲醛于4℃固定30min；再使用0.2％tritonx-100进行通透，室温作用20min；最后进行封闭，即使用5％脱脂乳和5％小牛血清37℃封闭30min。每一步都进行漂洗，pbst漂洗3次，每次5min。
2)抗体结合作用的检测：向细胞孔中加入稳定表达细胞的培养上清，37℃孵育2h。pbst漂洗3次，每次5min；加入1:100稀释的羊抗猪igg(h+l)-af488，(southernbiotech，货号6050-30)，37℃孵育1h。最后加入1:100稀释dapi(sigma，使用终浓度为10μg/ml)，100μl/孔，室温孵育10min，pbst洗后，加入蒸馏水进行荧光观察。
3、结果：
3.1、pc10-iga稳定表达细胞株cho的筛选及鉴定：
用质粒pcdna3.1(-)pc10-vh和pcdna3.1(-)pc10-vk质粒转染cho细胞，通过流式细胞仪分选和g418筛选，获得单克隆细胞株。通过elisa方法检测猪iga，筛选到稳定表达的细胞株。收取稳定表达细胞上清，应用elsia方法检测总的iga表达和特异性抗pedviga的表达，结果显示获得的细胞上清分泌iga(如图1a)，并且能够结合pedv(如图1b)。
上述分离得到的一株稳定表达全猪源抗pedvpc10-iga中和抗体的cho细胞系，命名为pc10-iga-cho，分类命名为稳定表达全猪源抗猪流行性腹泻病毒(pedv)中和抗体pc10-iga的cho细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmccno.15293，保藏日期为2018年1月29日。
3.2.通过pcr鉴定证实pc10-iga重、轻链成功整合到细胞中dna中并成功表达：
从获得单克隆cho细胞系中分别提取mrna和dna，采用rt-pcr和pcr方法扩增猪重链(heavy,h)、轻链(kappa,k)的基因。结果如图2所示，从所筛选的细胞株的mrna和dna中均可扩增到pc10-iga的重、轻链。扩增的特异条带大小分别为重链1500bp，轻链750bp。而未转染质粒载体cho细胞不能扩增出猪抗体iga重链和轻链特异的条带。因此，这些结果证实猪源pc10-iga抗体成功整合到cho细胞基因中并能够表达。
3.3.g418并不影响pc10-iga的表达：
检测结果表明，pc10-iga-cho细胞在含800μg/ml的g418培养液培养时，与去除g418的培养液培养的细胞表达情况基本相同(图3)。这结果说明细胞在800μg/ml的g418培养基中稳定一段时间后，抗性压力去除后，对细胞表达pc10-iga水平并无明显影响。
3.4.细胞系形态观察：
对pc10-iga-cho细胞体外培养不同时间后进行光镜下观察，发现细胞圆形分布，界限清楚，细胞形态显示良好，如图4所示。
3.5、获得的cho细胞株稳定表达pc10-iga：
为了分析所获得的pc10-iga-cho稳定表达细胞株是否能够稳定分泌pc10-iga，每隔48h收集不同时间的细胞培养上清，直至20天。应用猪igaelisa方法检测细胞上清中pc10-iga的浓度。以纯化的猪分泌型iga作为标准抗体绘制标准曲线，得到线性方程为y＝7.5585x+0.3479，相关系数r2＝0.9496(5c)。结果如图5所示，pc10-iga-cho细胞系能够分泌iga抗体，并且抗体的分泌随着时间的增加其分泌增加(5a)，在16天抗体分泌达到了峰值，表达浓度达到617μg/ml(5b)。
3.6、cho分泌表达的pc10-iga能够抑制pedv感染：
通过微孔ifa中和实验验证pc10-iga-cho细胞系分泌的pc10-iga抑制病毒的功能。结果发现，稳定表达细胞培养上清可以明显中和病毒，相对于对照，pedv病毒感染的细胞显著减少，在视野中只看到少量零星的红色荧光(图6a)。与ifa一致的结果，pc10-iga中和后相对于没有中和pedv病毒感染组，显著减少细胞感染上清中病毒含量，病毒量比没有中和病毒感染组降低了2个log10值(图6b)。
3.7、pc10-iga能够特异性结合pedv病毒感染的细胞：
将pc10-iga-cho细胞培养上清加入感染pedvcv777的vero-e6细胞，同时设未接毒的细胞对照。结果发现，pc10-iga-cho细胞培养上清能够与感染细胞的病毒蛋白结合，呈现特异的绿色荧光。pedv阴性血清无论与病毒感染孔，还是未感染的细胞孔均未出现特异的荧光出现；而pedv阳性血清在病毒感染孔有特异的荧光出现，细胞对照未出现绿色荧光(图7)。结果显示pc10-iga能够特异性结合pedv感染细胞后所表达的病毒蛋白。