本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别涉及一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物、rt-pcr检测试剂盒及其应用，适用于常见鸡传染性支气管炎病毒疫苗毒株的分型鉴定。
背景技术：
鸡传染性支气管炎是有世界性分布的、由鸡传染性支气管炎病毒引起的一种仅发生于鸡的急性、高度接触性的呼吸道疾病。各个日龄均易感，幼鸡以喘气为突出特征，在产蛋鸡出现蛋产量和品质下降。传染性支气管炎的流行对养鸡业造成了巨大的经济损失，严重制约了养禽业的发展。
鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科，冠状病毒属，其基因组因具有独特的先导引物转录机制，具有很高的错配率。在免疫接种等的影响下，ibv正以不同速度和不同进化方向发生变异，呈现出复杂的基因型和血清型。由于不同血清型ibv毒株之间交叉保护力弱，不对型的免疫加速了基因的变异，这给ib的免疫预防带来了很大困难。因此有必要对流行的ibv毒株类型进行准确的判断，给疫苗的使用提供及时的指导。
ibv的s蛋白具有免疫原性，被水解为两个亚基，s1和s2，其中s1蛋白决定ibv的血清型，并影响着病毒的组织噬性。病毒的血清分型需要通过中和实验，费时费力。calvinl.keeler(1998)等人对来自不同地区的31株ibv的s1糖蛋白进行了比较分析，以确定保守区和特异区，并设计特异性引物6对进行rt-pcr扩增与血清中和实验结果相符。
目前，市面上常见疫苗有h120株、ldt3-03株、4/91株和流行的qx株。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服常规检测手段的不足，提供一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物、rt-pcr检测试剂盒及方法、应用，为疫苗使用提供指导。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物，包括四对分型引物，所述引物的序列如下：
引物一：
h120上游引物：5’-attgcttacggtcctct-3’，
h120下游引物：5’-ctgctggttgacatctt-3’；
引物二：
qx上游引物：5’-gtacagggtcttgtccta-3’，
qx下游引物：5’-gtgttgcttaattcacct-3’；
引物三：
ldt3上游引物：5’-cgccacagcaggaagaat-3’，
ldt3下游引物：5’-gtccgtagttggaatgaaga-3’；
引物四：
4/91上游引物：5’-ccagataggcggtgttag-3’，
4/91下游引物：5’-tcggcaataggaaagtgt-3’。
为了更好的实现上述发明目的，本发明提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测试剂，所述试剂包括以下组分：rna提取试剂、反转录试剂、pcr反应试剂、四对分型引物、阳性对照样；
所述引物的序列如下：
引物一：
h120上游引物：5’-attgcttacggtcctct-3’，
h120下游引物：5’-ctgctggttgacatctt-3’；
引物二：
qx上游引物：5’-gtacagggtcttgtccta-3’，
qx下游引物：5’-gtgttgcttaattcacct-3’；
引物三：
ldt3上游引物：5’-cgccacagcaggaagaat-3’，
ldt3下游引物：5’-gtccgtagttggaatgaaga-3’；
引物四：
4/91上游引物：5’-ccagataggcggtgttag-3’，
4/91下游引物：5’-tcggcaataggaaagtgt-3’。
优选地，所述引物的浓度为20μm。
所述rna提取试剂包括：裂解液，洗涤液，磁珠，depch2o；
所述反转录试剂包括：5×m-mlv的buffer，10mm的dntps，40u/μl的rri，200u/μl的m-mlv，100μm的randomprimer；
所述pcr反应试剂包括：ddh2o，2×extaqpcrmix(含dntps)；
所述阳性对照样为：分别从h120株、ldt3-03株、4/91株和流行的qx种毒接种鸡胚收集尿囊液抽提rna的反转录产物为阳性对照样cdna。
一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测试剂盒，为含有上述rt-pcr检测试剂的试剂盒。
所述引物、或所述检测试剂、或所述试剂盒，在鉴定鸡传染性支气管炎病毒活疫或制备鉴定鸡传染性支气管炎病毒活疫检测产品中的应用。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测方法，所述检测方法包括：
（1）样品rna的提取：取200μl样品，用磁珠法试剂提取rna，用50μldepch2o溶解，得到总rna；
（2）以步骤（1）获得的总rna为模板，进行反转录反应，获得反转录产物样品cdna；
（3）使用四对分型引物中的每对分型引物分别以步骤（2）获得的样品cdna和阳性对照样cdna为模板，组成8个反应体系进行pcr反应，实现梯度pcr扩增，得到8种pcr反应液；
（4）取步骤（3）获得的pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据条带对照阳性进行结果判定。
其中，步骤（2）所述反转录反应的体系为：取步骤（1）获得的总rna5.5μl，加入8μl10mm的dntps，1.5μl100μm的randomprimer，4μl5×m-mlv的buffer，0.5μl40u/μl的rri，0.5μl200u/μl的m-mlv至20μl混匀；所述反转录反应条件为：30℃×10min，42℃×1h，70℃×5min。
步骤（3）所述的pcr反应体系均为：10μl2×extaqpcrmix(含dntps)，1μl浓度为20μm的上游引物，1μl浓度为20μm的下游引物，2μl样品cdna模板或者2μl阳性对照样cdna模板，加6μlddh2o至20μl；所述pcr反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性35s、55℃或60℃梯度（其中h120和qx为60℃，ldt3和4/91为55℃）退火35s、72℃延伸45s，再从所述变性开始进行总共32个循环后，72℃总延伸10min。
本发明提供的引物是通过对genbank中公布的ibv的mass、ldt3、4/91、qx等分型的多个毒株基因组序列s1基因序列进行比较分析，找出保守区和特异区设计而成。
本发明中，h120引物扩增获得的pcr产物片段大小为447bp，qx引物扩增获得的pcr产物片段大小为829bp，ldt3引物扩增获得的pcr产物片段大小为787bp，4/91引物扩增获得的pcr产物片段大小为233bp。
本发明的有益效果是：ib血清型复杂多样，血清学试验鉴定费时费力，本发明仅通过一次反转录，一个梯度pcr过程，通过电泳观察产物片段大小，即可判定疫苗是否含有h120、qx、ldt3、4/91等毒株类型；本发明提供的试剂盒仅通过一次梯度rt-pcr分别扩增出四条不同大小的片段，就可以对鸡传染性支气管炎的疫苗株和流行野毒株进行快速鉴别诊断，且具有高效便捷、低成本、特异性强、灵敏度高等特点，为鸡传染性支气管病毒的鉴别诊断和分子流行病学分析以及鸡传染性支气管炎病毒的防控提供一种方便快捷的检测方法，为临床上疫苗筛选提供依据，对ib的防控具有重要意义。
附图说明
图1为试剂盒引物一对阳性模板pcr扩增的电泳结果图；其中，mk、2000bpmarker；1、h120;2、qx;3、ldt3;4、4/91。
图2为试剂盒引物二对阳性模板pcr扩增的电泳结果图；其中，mk、2000bpmarker；1、h120;2、qx;3、ldt3;4、4/91。
图3为试剂盒引物三对阳性模板pcr扩增的电泳结果图；其中，mk、2000bpmarker；1、h120;2、qx;3、ldt3;4、4/91。
图4为试剂盒引物四对阳性模板pcr扩增的电泳结果图；其中，mk、2000bpmarker；1、h120;2、qx;3、ldt3;4、4/91。
图5为试剂盒检测一瓶传染性支气管炎商品苗的电泳结果图；其中，mk、2000bpmarker;y1、样品h120扩增；p1、h120阳性对照；n1、h120阴性对照；y2、样品qx扩增；p2、qx阳性对照；n2、qx阴性对照；y3、样品ldt3扩增；p3、ldt3阳性对照；n3、ldt3阴性对照；y4、样品4/91扩增；p4、4/91阳性对照；n4、4/91阴性对照。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1引物
本发明实施例提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物，包括四对分型引物，引物的序列如下：
引物一：
h120上游引物：5’-attgcttacggtcctct-3’，
h120下游引物：5’-ctgctggttgacatctt-3’；
引物二：
qx上游引物：5’-gtacagggtcttgtccta-3’，
qx下游引物：5’-gtgttgcttaattcacct-3’；
引物三：
ldt3上游引物：5’-cgccacagcaggaagaat-3’，
ldt3下游引物：5’-gtccgtagttggaatgaaga-3’；
引物四：
4/91上游引物：5’-ccagataggcggtgttag-3’，
4/91下游引物：5’-tcggcaataggaaagtgt-3’。
实施例2检测试剂
本发明实施例提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测试剂，包括以下组分：rna提取试剂、反转录试剂、pcr反应试剂、四对分型引物、阳性对照样；
其中，引物的序列如下：
引物一：
h120上游引物：5’-attgcttacggtcctct-3’，
h120下游引物：5’-ctgctggttgacatctt-3’；
引物二：
qx上游引物：5’-gtacagggtcttgtccta-3’，
qx下游引物：5’-gtgttgcttaattcacct-3’；
引物三：
ldt3上游引物：5’-cgccacagcaggaagaat-3’，
ldt3下游引物：5’-gtccgtagttggaatgaaga-3’；
引物四：
4/91上游引物：5’-ccagataggcggtgttag-3’，
4/91下游引物：5’-tcggcaataggaaagtgt-3’。
引物的浓度为20μm。
rna提取试剂包括：裂解液，洗涤液，磁珠，depch2o；
反转录试剂包括：5×m-mlv的buffer，10mm的dntps，40u/μl的rri，200u/μl的m-mlv，100μm的randomprimer；
pcr反应试剂包括：ddh2o，2×extaqpcrmix(含dntps)。
阳性对照样为：分别从h120株、ldt3-03株、4/91株和流行的qx种毒接种鸡胚收集尿囊液抽提rna的反转录产物为阳性对照样cdna。
实施例3检测试剂盒
本发明实施例提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测试剂盒，具体为含有实施例2提供的用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测试剂的试剂盒。
实施例4检测方法
本发明实施例提供了一种用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的rt-pcr检测方法，所述检测方法包括：
（1）样品rna的提取：取200μl样品，用磁珠法试剂提取rna，用50μldepch2o溶解，得到总rna；
（2）以步骤（1）获得的总rna为模板，进行反转录反应，获得反转录产物样品cdna；
（3）使用四对分型引物中的每对分型引物分别以步骤（2）获得的样品cdna和阳性对照样cdna为模板，组成8个反应体系进行pcr反应，实现梯度pcr扩增，得到8种pcr反应液；
（4）取步骤（3）获得的pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据条带对照阳性进行结果判定。
其中，步骤（2）所述反转录反应的体系为：取步骤（1）获得的总rna5.5μl，加入8μl10mm的dntps，1.5μl100μm的randomprimer，4μl5×m-mlv的buffer，0.5μl40u/μl的rri，0.5μl200u/μl的m-mlv至20μl混匀；所述反转录反应条件为：30℃×10min，42℃×1h，70℃×5min。
步骤（3）所述的pcr反应体系均为：10μl2×extaqpcrmix(含dntps)，1μl浓度为20μm的上游引物，1μl浓度为20μm的下游引物，2μl样品cdna模板或者2μl阳性对照样cdna模板，加6μlddh2o至20μl；所述pcr反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性35s、55℃或60℃梯度（其中h120和qx为60℃，ldt3和4/91为55℃）退火35s、72℃延伸45s，再从变性开始进行总共32个循环后，72℃延伸10min。
实施例5检测试剂盒特异性验证
本发明实施例对实施例3提供的试剂盒进行特异性验证，具体步骤如下：
（1）阳性对照样rna的提取：四种阳性样品各取200μl用磁珠法试剂盒提取，用50μldepch2o溶解，得总rna；
（2）以步骤（1）获得的总rna为模板，进行反转录反应，获得反转录产物阳性对照样cdna；
反应体系为：取步骤（1）获得的总rna5.5μl，加入8μl10mm的dntps，1.5μl100μm的randomprimer，4μl5×m-mlv的buffer，0.5μl40u/μl的rri，0.5μl200u/μl的m-mlv至20μl混匀；所述反转录反应条件为：30℃×10min，42℃×1h，70℃×5min。
（3）以步骤（2）获得的阳性对照样cdna为模板，使用四对分型引物分别配4个体系进行pcr反应，实现梯度pcr扩增，得到4种pcr反应液；
4个pcr反应体系均为：10μl2×extaqpcrmix(含dntps)，1μl浓度为20μm的上游引物，1μl浓度为20μm的下游引物，2μl阳性对照样cdna模板，加6μlddh2o至20μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性35s、55℃或60℃梯度（其中h120和qx为60℃，ldt3和4/91为55℃）退火35s、72℃延伸45s，再从变性开始进行总共32个循环后，72℃总延伸10min。
（4）取步骤（3）获得的4种pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，如图1-4，结果显示其四对引物特异性好：引物一仅扩增出h120毒株目的条带447bp，其他三株毒均为阴性；引物二仅扩增qx毒株获得片段大小为829bp的条带,其他三株毒均为阴性；引物三仅扩增ldt3毒株获得片段大小为787bp的条带,其他三株毒均为阴性；引物四仅扩增4/91获得片段大小为233bp的条带，其他三株毒均为阴性。
实施例6应用
本发明实施例提供了一种引物、或检测试剂、或检测试剂盒，用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的应用，具体为使用本发明试剂盒用于检测临床一瓶传染性支气管炎商品苗的毒株鉴定。具体步骤如下：
（1）疫苗rna的提取
将冻干苗用2mlddh2o稀释混匀，抽取200μl稀释液，用invitrogenrna提取试剂盒提取rna，用50μldepch2o溶解，得到总rna；
（2）反转录反应
以步骤（1）得到的总rna为模板，进行反转录反应，反应体系为：取步骤（1）获得的总rna5.5μl，加入8μl10mm的dntps，1.5μl100μm的randomprimer，4μl5×m-mlv的buffer，0.5μl40u/μl的rri，0.5μl200u/μl的m-mlv至20μl混匀；所述反转录反应条件为：30℃×10min，42℃×1h，70℃×5min，得反转录产物样品cdna；
（3）pcr反应
使用四对分型引物中的每对分型引物分别以步骤（2）获得的样品cdna和阳性对照样cdna为模板，组成8个反应体系进行pcr反应，实现梯度pcr扩增，得到8种pcr反应液；
步骤（3）的pcr反应体系均为：10μl2×extaqpcrmix(含dntps)，1μl浓度为20μm的上游引物，1μl浓度为20μm的下游引物，2μl样品cdna模板或者2μl阳性对照样cdna模板，加6μlddh2o至20μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性35s、55℃或60℃梯度（其中h120和qx为60℃，ldt3和4/91为55℃）退火35s、72℃延伸45s，再从变性开始进行总共32个循环后，72℃总延伸10min；
（4）取步骤（3）获得的pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据条带对照阳性进行结果判定；如图5所示其四对引物扩增获得的pcr产物分别在h120和ldt3引物处有两条带，其片段大小分别与h120和ldt3引物预期片段大小相符，此结果与疫苗厂家标注相符。
以上实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从生物试剂公司购买
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。