本发明涉及牛血清白蛋白的化学修饰领域，具体涉及一种用于Lp-PLA2、NGAL和Derf24增强免疫的方法，主要是利用1,5-戊二胺和1,10-癸二胺修饰的牛血清白蛋白作为载体蛋白，分别与重组人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白(Lp-PLA2)，重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和重组粉尘螨过敏原Derf24蛋白抗原偶联，制备免疫原，用于免疫小鼠。
背景技术：
现有研究表明，脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-Associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)是一种血管炎性反应标志物，其活性及其含量与脉粥样硬化斑块引起的心脑血管疾病事件呈显著正相关。通过检测血液中的Lp-PLA2，可以有效地了解动脉粥样硬化斑块内的炎症程度及其稳定性，从而可以预警心脑血管事件的发生，对预防严重的心肌梗死和脑血栓具有一定的临床价值[1,2]。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)属于lipocalin蛋白家族，最初是在激活中性粒细胞中被发现的一种小分子量分泌性蛋白。近年来研究表明，NGAL能迅速、灵敏、特异地反映各种急性肾损伤，可成为检测早期肾损伤的生物学指标[3]。
粉尘螨过敏原Derf24是细胞色素C还原酶结合蛋白(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)的同源物，被世界卫生组织与国际免疫联合会下属的过敏原国际命名委员会正式命名为尘螨第24组过敏原；这一组份与人体蛋白的同源性高达50％[4]。这为研究致敏机制提供了一类新的材料，并且作为一种主要过敏原，可能用于开发疫苗和诊断试剂。目前特异性免疫治疗即过敏原脱敏疫苗治疗被公认为唯一针对变态反应疾病病因的治疗方法。通过尘螨提取物的标准化研究，可以开发出了相应的尘螨脱敏疫苗和诊断试剂[4]。
临床或者实验研究通常采用免疫分析方法对上述微量生物标志物进行定量分析。其中，获得高效价抗体是关键，对免疫分析方法的灵敏度、特异性等起着至关重要的作用。为此，需要探索新的方法以获得高亲和力特异的抗体。
一般来讲，抗原蛋白通过与大分子的载体蛋白进行化学偶联后制备成完全抗原，可以更好地诱导实验动物产生高效价的抗体。在完全抗原对机体进行免疫应答的过程中，载体蛋白会使机体的免疫系统产生强烈的T细胞表位，从而达到帮助目标抗原产生特异性B细胞，进行克隆活化、分裂、增殖，并分泌针对新B细胞表位的抗体[7]。理想的载体蛋白分子应该有极强的免疫原性并可与半抗原偶联结合，且有较好的溶解度。通常选用的蛋白载体有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)等。其中，牛血清白蛋白(BSA)性质稳定、价格低廉、易于偶联、水溶性好，是最为常用的载体蛋白分子之一[5]。
为了获得特异性效价更高的抗体，可利用乙二胺化学修饰BSA中的游离羧基制备阳离子牛血清白蛋白(c2BSA)，再使用c2BSA作为载体蛋白偶联生物标志物抗原进行小鼠免疫诱导实验[5]。这可能由于其与细胞膜上带负电的抗原递呈细胞，有更好的亲和性。所以，使用c2BSA作为载体蛋白时，可以加快小鼠机体免疫应答的速度，使动物体内可以产生更高效价的抗体[5]。
但在实际应用过程中我们发现，使用c2BSA(即使用乙二胺修饰牛血清白蛋白)作为载体蛋白进行免疫小鼠实验所制备Lp-PLA2、NGAL和Derf24的抗体滴度分别达到1x105、2x105和4x105；仍不能满足检测要求。为此，有必要开发新型阳离子载体蛋白以在免疫加强实验中制备效价更高的抗体，用于检测。
参考文献
[1].Packard CJ et al.,Lipoprotein-associated phospholipase A2 as an independent predictor of coronary heart disease.N Engl J Med.2000；343(16):1148-55.
[2].Thompson Aet al.,Lipoprotein-associated phospholipase A(2)and risk of coronary disease,stroke,and mortality:collaborative analysis of 32prospective studies,Lancet.2010；375(9725):1536-44.
[3].Antonucci E1,et.al.,Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL):a promising biomarker for the early diagnosis of acute kidney injury(AKI).Acta Biomed.2014Dec17；85(3):289-94.
[4].Chan TF et.al.,The draft genome,transcriptome,and microbiome of Dermatophagoides farinae reveal a broad spectrum of dust mite allergens.J Allergy Clin Immunol.2015Feb；135(2):539-48.
[5].Gao Y et.al.,Preparation of highly specific anti-zearalenone antibodies by using the cationic protein conjμgate and development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.Analyst.2012Jan 7；137(1):229-36.
技术实现要素：
针对上述问题，本发明目的在于提供一种新型阳离子载体蛋白及其制备方法，用于偶联重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)、重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和重组Derf24，达到增强免疫，制备特异性效价更高的抗体的目的。
本发明通过以下技术方案来实现，一种新型阳离子载体蛋白的制备方法，使用一定比例的1,5-二氨基戊烷(1,5-戊二胺)和1,10-二氨基癸烷(1,10-癸二胺)同时与BSA(牛血清白蛋白)偶联，制备出阳离子化牛血清白蛋白。
通过大量的实验研究发现，相比于商品化的二乙胺修饰的BSA载体，由于链的延长使得戊二胺和癸二胺修饰的BSA更有利于偶联抗原位点暴露；而且戊二胺和癸二胺同时修饰的BSA载体使得偶联抗原位点暴露位置变化多样，更有利于产生丰富的免疫B细胞。
其中，所述1,5-二氨基戊烷(1,5-戊二胺)和1,10-二氨基癸烷(1,10-癸二胺)的摩尔数比2:1。
通过大量的实验研究发现，该摩尔比制备的阳离子化BSA免疫增强效果比不在该选择范围摩尔数比制备的阳离子化BSA高5倍以上。
所述1,5-戊二胺和1,10-癸二胺总量与BSA的比例范围重量比1:2。
通过大量的实验研究发现，该重量比制备的阳离子化BSA免疫增强效果比不在该选择范围摩尔数比制备的阳离子化BSA高3倍以上。
作为本发明的进一步优选方案，所述制备方法包括：
(1)、将200mg的1,5-戊二胺(CAS:462-94-2)和168.6mg的1,10-癸二胺(CAS:646-25-3)加入20ml H2O中，用6N HCl调pH到4.75，总体积调为50ml，平衡至室温(25℃)；
(2)、在上述溶液加入737.2mg BSA(溶于5ml H2O中)；
(3)、在上述溶液加入220mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDC，CAS:25952-53-8)，室温搅拌1小时；
(4)、配4M的pH＝4.75醋酸缓冲液加3.5ml终止上述溶液反应；
(5)、用50mM的pH＝6MES对上述溶液进行透析；
(6)、测定浓度后分装冻干，保存于4℃，得到所述阳离子载体蛋白。
一种新型阳离子载体蛋白(简称c510BSA)，所述新型阳离子载体蛋白为阳离子化牛血清白蛋白，通过前述制备方法制得。
本发明的另一目的在于提供一种用于Lp-PLA2、NGAL和Derf24增强免疫的方法，包括：将前述阳离子化载体蛋白作为载体蛋白，分别偶联重组人脂蛋白相关磷脂酶A2、重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和重组Derf24，得到偶联蛋白，对小鼠注射给药，实现免疫。
所述免疫方法进一步包括，用无菌水将上述偶联蛋白稀释至1mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml的抗原溶液与等量的弗氏完全佐剂混合后，对实验小鼠进行免疫，每只小鼠皮下注射100μg，每隔一周免疫一次，共计免疫4次。
通过前述方法制备所得的阳离子化牛血清白蛋白可经冻干后长期稳定保存，与重组蛋白偶联重复性好，免疫增强显著。
本发明的原理是，利用1,5-戊二胺和1,10-癸二胺通过偶联反应，将天然BSA蛋白上游离的羧基(谷氨酸、天冬氨酸或者羧基端)修饰为氨基，制备阳离子化牛血清白蛋白；使用上述阳离子化牛血清白蛋白作为载体蛋白对重组人脂蛋白相关磷脂酶A2、重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和重组Derf24偶联，再进行免疫实验时,可以显著增强免疫作用，进而达到制备特异性效价更高的抗体的目的。
使用本发明设计得到的载体蛋白作为载体蛋白进行免疫小鼠实验，所制备Lp-PLA2、NGAL和Derf24的抗体滴度在加强免疫均达到1:320000(备注OD>1.0，且阴性对照OD<0.2)。
附图说明
图1，阳离子修饰的BSA(c510BSA)示意图；
图2，Lp-PLA2重组蛋白与不同免疫载体偶联后4次免疫抗血清效价；
图3，Lp-PLA2重组蛋白与不同免疫载体偶联后加强免疫抗血清效价；
图4，Lp-PLA2重组蛋白与不同免疫载体偶联免疫效价比较；
图5，NGAL重组蛋白与不同免疫载体偶联后4次免疫抗血清效价；
图6，NGAL重组蛋白与不同免疫载体偶联后加强免疫抗血清效价；
图7，NGAL重组蛋白与不同免疫载体偶联免疫效价比较；
图8，Derf24与不同免疫载体偶联后4次免疫抗血清效价；
图9，Derf24与不同免疫载体偶联后加强免疫抗血清效价；
图10，Derf24与不同免疫载体偶联免疫效价比较。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例一：阳离子化牛血清白蛋白(简称c510BSA)的制备
用1,5-戊二胺和1,10-癸二胺将天然牛血清白蛋白修饰制备成阳离子化牛血清白蛋白，修饰具体步骤如下：
(1)、将200mg的1,5-戊二胺(CAS:462-94-2)和168.6mg的1,10-癸二胺(CAS:646-25-3)加入20ml H2O中，用6N HCl调pH到4.75，总体积调为50ml，平衡至室温(25℃)；
(2)、在上述溶液加入737.2mg BSA(溶于5ml H2O中)；
(3)、在上述溶液加入220mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDC，CAS:25952-53-8)，室温搅拌1小时；
(4)、配4M的pH＝4.75醋酸缓冲液加3.5ml终止上述溶液反应；
(5)、用50mM的pH＝6MES对上述溶液进行透析；
(6)、测定浓度后分装冻干，保存于4℃，得到所述阳离子化BSA(简称c510BSA)，如图1所示，备用。
实施例二：c510BSA–LP-PLA2免疫原的偶联合成
阳离子化牛血清白蛋白c510BSA与重组人脂蛋白相关磷脂酶A2，偶联具体步骤如下：
(1)、取1ml的LP-PLA2重组蛋白(R&D公司产品，5mg)溶于1ml MES(pH6.0)缓冲液中，共三组；
(2)、在蛋白溶液中加入EDC 4.3mg室温反应5min；
(3)、用0.5M Na2HPO4调至pH＝7.2；
(4)、在上述溶液中加入5.9mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应20min；
(5)、取2mg的阳离子化牛血清白蛋白c510BSA、nBSA(未修饰)、KLH分别加入蛋白溶液中反应1.5小时；
(6)、蛋白偶联混合物透析至PBS(pH7.2)，制得c510BSA-LP-PLA2重组蛋白免疫原、nBSA-LP-PLA2重组蛋白免疫原、KLH-LP-PLA2重组蛋白免疫原，测定蛋白浓度分装冻干。
实施例三：c510BSA-LP-PLA2蛋白免疫原偶联物的免疫效应
(1)、准备免疫抗原为实施例二中制备的c510BSA-LP-PLA2重组蛋白免疫原偶联物，天然牛血清白蛋白(nBSA)与LP-PLA2重组蛋白的偶联物nBSA-LP-PLA2，以及血蓝蛋白(KLH)与LP-PLA2重组蛋白的偶联物KLH-LP-PLA2；
(2)、用实施例二制得的c510BSA-LP-PLA2、nBSA-LP-PLA2以及KLH-LP-PLA2免疫原采用常规方法分别接种实验动物小鼠(BALB/c)，加强免疫后取小鼠抗血清，具体步骤如下：
用无菌水将上述合成的c510BSA-LP-PLA2、nBSA-LP-PLA2以及KLH-LP-PLA2免疫原稀释至1mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml的抗原溶液与等量的弗氏完全佐剂混合后对实验小鼠进行免疫，每只小鼠皮下注射100μg；
1周后，再用1.0ml的抗原溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合后对实验小鼠进行免疫，每隔一周免疫一次，共计免疫4次；将免疫后实验小鼠取血分离得到抗LP-PLA2的特异性抗体，并以重组LP-PLA2蛋白进行酶联免疫吸附试验(ELISA)进行验证比较抗体效价。
(3)、图2和图3为实施例三中LP-PLA2重组蛋白半抗原与不同免疫载体偶联后进行4次免疫和加强免疫后检测其血清效价比较，以c510BSA作为免疫载体比以天然的BSA或KLH作为免疫载体使免疫小鼠产生更高的LP-PLA2特异性抗体(图4)。
实施例四：阳离子化牛血清白蛋白c510BSA与重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)偶联，偶联具体步骤如下：
(1)、取5mg的NGAL抗原(R&D公司产品)溶于1ml MES(pH6.0)缓冲液中，共三组；
(2)、称取EDC 4.7mg加入蛋白溶液中反应5min；
(3)、用0.5M Na2HPO4调pH＝7.2；
(4)、称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)5.3mg加入蛋白溶液中反应15min；
(5)、取2mg的c510BSA、nBSA(未修饰的BSA)、KLH分别加入蛋白溶液中反应2小时；
(6)、蛋白偶联混合物透析至PBS(pH7.2)，制得c510BSA-NGAL重组蛋白免疫原、nBSA-NGAL重组蛋白免疫原和KLH-NGAL重组蛋白免疫原，测定蛋白浓度分装冻干。
实施例五：c510BSA-NGAL蛋白免疫原偶联物的免疫效应
(1)、准备免疫抗原为实施例二中制备的c510BSA-NGAL重组蛋白免疫原偶联物，天然牛血清白蛋白(nBSA)与NGAL重组蛋白的偶联物nBSA-NGAL，以及血蓝蛋白(KLH)与NGAL重组蛋白的偶联物KLH-NGAL；nBSA-NGAL和KLH-NGAL均使用实施例四的偶联方案。
(2)、用实施例四制得的c510BSA-NGAL、nBSA-NGAL以及KLH-NGAL免疫原采用常规方法分别接种实验动物小鼠(BALB/c)，加强免疫后取小鼠抗血清，具体步骤如下：
用无菌水将上述合成的c510BSA-NGAL、nBSA-NGAL以及KLH-NGAL免疫原稀释至1mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml的抗原溶液与等量的弗氏完全佐剂混合后对实验小鼠进行免疫，每只小鼠皮下注射100μg；
1周后，再用1.0ml的抗原溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合后对实验小鼠进行免疫，接下来每隔一周免疫一次，共计免疫注射4次；将上述免疫后实验小鼠进行取血分离得到抗NGAL的特异性抗体，并以重组NGAL蛋白进行酶联免疫吸附试验(ELISA)进行验证比较抗体效价。
(3)、图5和图6为实施例三中NGAL重组蛋白半抗原与不同免疫载体偶联后进行4次免疫和加强免疫后检测其血清效价比较，以c510BSA作为免疫载体比以天然的BSA或KLH作为免疫载体使免疫小鼠产生更高的NGAL特异性抗体(图7)。
实施例六：c510BSA-Derf24免疫原的偶联合成
c510BSA-Derf24免疫原由阳离子化牛血清白蛋白c510BSA与人Derf24重组蛋白偶联而成，偶联具体步骤如下：
(1)、取10mg的人Derf24重组蛋白溶于1ml MES(pH6.0)缓冲液中，共三组；
(2)、取5mg的c510BSA、nBSA(未修饰的BSA)、KLH分别加入蛋白溶液中，混匀；
(3)、将2.5mg的EDC溶于200μl的MES缓冲液中，立即加入上述三种溶液混匀后，室温下磁力搅拌器搅拌2小时；
(4)、将反应结束的蛋白溶液在4℃下用PBS(pH7.2)透析，制得c510BSA-Derf24、nBSA-Derf24、KLH-Derf24免疫抗原，测定蛋白浓度分装冻干。
实施例七：c510BSA-Derf24免疫原偶联物的免疫效应
用实施例六所制得的c510BSA-Derf24、nBSA-Derf24以及KLH-Derf24(其偶联方案与实施例六一致)对实验动物小鼠的免疫、取血、检测均参照实施例三中的步骤进行，在免疫第4次结束后以及加强免疫后进行取血，并以Derf24作为检测原(其偶联方案与实施例四一致)进行ELISA进行验证比较抗体效价。
图8和图9为实施例七中Derf24与不同免疫载体偶联后进行4次免疫和加强免疫后检测其血清效价比较，以c510BSA作为免疫载体比以天然的BSA或KLH作为免疫载体使免疫小鼠产生更高的Derf24特异性抗体(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。