本发明涉及一种东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因，属于动物生物技术领域。
背景技术：
随着养牛业的快速发展，粪便污染已成为一大难题，一头奶牛每年产生的粪便在7吨以上。由于各地对牛粪的处理普遍重视不够，一些养牛比较集中的地方，基本上都没有牛粪处理设施，这就导致牛粪到处堆放，尤其到夏天，臭气冲天，既对周围居民的正常生活造成不良影响，同时，牛粪又是多种细菌病原体孳生繁殖的源头，对养殖群体有着严重的影响。另外，生牛粪上地，产生热量，消耗土壤氧气，导致烧根烧苗，还对寄生虫的卵、病原微生物起到传播作用。因此，牛粪处理显得十分重要。东方铃蟾(bombinaorientalis)是铃蟾科、铃蟾属的两栖纲脊椎动物，体长36-48mm，头扁平，吻圆，前、后肢短，皮肤粗糙，刺黑色，背部呈灰棕色，或背为绿色杂以不规则的黑色斑点，腹面有花斑，为黑色与朱红色或桔黄色。东方铃蟾为肉食性物种，可全天捕食，食物包括蚂蚁、姬蜂、蚊蝇类、鳞翅目幼虫、蝽类、甲虫、蜘蛛、田螺等蛋白质含量较高的动物，但是，东方铃蟾的粪便几乎没有臭味，其中，芽孢杆菌发挥了重要作用。如何在东方铃蟾粪便中寻找到能够处理粪便中氨氮的芽孢杆菌，找到表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的基因成为急需解决的一大难题？所以，发明东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因，寻找到一个表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因是必要的。
技术实现要素：
为了克服如何在东方铃蟾粪便中寻找到能够处理粪便中氨氮的芽孢杆菌，找到表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的基因的难题，本发明提供了一个东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因，将实验用混合物置于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力；结果可知，7个小时后，混合物中氨氮含量为零，即该基因的表达蛋白将泌乳奶牛粪便中的氨氮全部清除掉，可见东方铃蟾肠道芽孢杆菌ness1-a基因的表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有较强除臭能力。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因的核酸序列为seqidno：1，具体构建及验证过程如下：
1.基因的pcr扩增：将从中国黑龙江省帽儿山抓获的东方铃蟾肠道中提取的芽孢杆菌(bacillussp.)基因组dna使用ness-5/ness-3引物对进行pcr扩增，引物序列见表1。参照genbank中公布的ness1-a基因编码区的n端和c端序列同源性，设计合成一对特异性引物ness5/ness3，分别在5’端引入ndei和sali酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。根据全长基因的不同位点设计合成ness51、ness52、ness31、ness32四条引物，在5’端引入bamhi和sali酶切位点(箭头所示)，用于构建缺失基因。
2.pcr反应体系：kod聚合酶反应体系50μl；kod酶1μl；引物对(10mmol/l)1μl；模板1μl；10xpcrbuffer5μl；mgso43μl；dntp5μl；ddh2o补足至50μl；
3.pcr反应条件(表2)
4.dna回收：(1)使用灭菌解剖刀切下含目的dna片段的凝胶，置于1.5ml离心中；(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液a，置于50℃水浴锅中10min左右；(3)待胶完全溶解后加入0.5个a溶胶缓冲液体积的b溶液；(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液w1500μl，12000r/min离心1min；(6)去除残留液体，洗脱缓冲液w2700μl，洗脱两次；(7)将30μl的te溶液加入回收柱中，室温静置2min；(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。
5.连接反应：将dna胶回收产物与peb载体按照连接体系(目的片段dna4μl，载体dna1μl，连接试剂盒solutioni5μl)进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。
6.大肠杆菌热激转化：将连接产物全量加入到100μl大肠杆菌jm109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管，42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μllb液体培养基37℃培养1h左右，取200μl于lb固体平板涂布，加入相应的抗生素，x-gal溶液40μl，iptg溶液4μl，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以peb载体的正向引物pebf和所克隆基因的反向引物进行pcr鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌rosetta菌株感受态细胞中。经pcr、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。
7.大肠杆菌质粒dna提取：(1)挑取阳性转化子于lb液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；(2)加入250μl含有50mg/mlrnanase的s1溶液悬浮沉淀；(3)加入250μl细菌裂解液s2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；(4)加入350μls3中和液并充分温和地上下翻转6-8次，12000r/min下离心10分钟；(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(6)随后加入500μl洗涤液w1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(7)随后加入700μl，w2，洗去多余盐分，12000r/min条件下离心1分钟，之后重复一次；(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μl预热至65℃的te缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。
8.基因的诱导表达：(1)将大肠杆菌的单菌落接种于lb液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mllb液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至od600＝0.6左右；之后加入1m的iptg200μl；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，表达菌株不同条件也不同；(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/ltris·cl(ph调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/ltris·cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即sds-page。
9.蛋白电泳检测：电泳：将粗蛋白样品与3x上样buffer按2∶1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10(l上样，电泳仪设置120v预电泳10-15min，然后进行150v恒压电泳1h。染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mlsi溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入sii和siii的混合液中(每50mlsii加200(lsiii)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。
10.序列测定及分析：由美国lcsciences中国公司完成序列测定，用clonemanager、omiga、ncbiblast、dnaman等软件分析序列，结果为seqidno：1。
11.表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力活性测定
称取30g泌乳奶牛新鲜粪便置灭菌培养皿中，加入3ml待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置。将混有待测样品溶液的泌乳奶牛新鲜粪便分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中，对各个孔进行编号，分别编号为1-24，每孔放入0.2g混合物。将3个24孔细胞培养板置于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力。经过7小时的处理，基本可以将混合物中的氨氮清除掉，混合物的除臭能力较强。
本发明的有益效果为：本发明东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因，将混有待测样品溶液的泌乳奶牛新鲜粪便分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中，对各个孔进行编号，分别编号为1-24，每孔放入0.2g混合物。将3个24孔细胞培养板置于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力；结果可知，7个小时后，混合物中氨氮含量为零，即该基因的表达蛋白将泌乳奶牛粪便中的氨氮全部清除掉，可见东方铃蟾肠道芽孢杆菌ness1-a基因的表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有较强除臭能力。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的ness1-a基因的核酸序列(seqidno：1)。
具体实施方式
实施例一
1.基因的pcr扩增：
将从中国黑龙江省帽儿山抓获的东方铃蟾肠道中提取的芽孢杆菌(bacillussp.)提取的芽孢杆菌基因组dna使用ness-5/ness-3引物对进行pcr扩增，引物序列见表1。参照genbank中公布的ness3a基因编码区的n端和c端序列同源性，设计合成一对特异性引物ness5/ness3，分别在5’端引入ndei和sali酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。根据全长基因的不同位点设计合成ness51、ness52、ness31、ness32四条引物，在5’端引入bamhi和sali酶切位点(箭头所示)，用于构建缺失基因。
表1：引物序列
2.pcr反应体系
3.pcr反应条件
表2：pcr反应条件
4.dna回收
(1)使用灭菌解剖刀切下含目的dna片段的凝胶，置于1.5ml离心管中；
(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液a，置于50℃水浴锅中水浴10min左右；
(3)待溶胶完全溶解后加入0.5个a溶胶缓冲液体积的b溶液；
(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；
(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液w1500μl，12000r/min离心1min；
(6)去除残留液体，洗脱缓冲液w2700μl，洗脱两次；
(7)将30μl的te溶液加入回收柱中，室温静置2min；
(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。
5.连接反应
将dna胶回收产物与peb载体按照以下连接体系进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。
目的片段dna4μl
载体dna1μl
连接试剂盒solutioni5μl
6.大肠杆菌热激转化
将连接产物全量加入到100μl大肠杆菌jm109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管，42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μllb液体培养基37℃培养1h左右，取200μl于lb固体平板涂布，加入相应的抗生素，x-gal溶液40μl，iptg溶液4μl，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以peb载体的正向引物pebf和所克隆基因的反向引物进行pcr鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌rosetta菌株感受态细胞中。经pcr、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。
7.大肠杆菌质粒dna提取
(1)挑取阳性转化子于lb液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；
(2)加入250μl含有50mg/mlrnanase的s1溶液悬浮沉淀；
(3)加入250μl细菌裂解液s2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；
(4)加入350μls3中和液并充分温和地上下翻转6-8次，12000r/min下离心10分钟；
(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；
(6)随后加入500μl洗涤液w1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；
(7)随后加入700μl，w2，洗去多余盐分，12000r/min条件下离心1分钟，之后重复一次；
(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μl预热至65℃的te缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。
8.基因的诱导表达
(1)将大肠杆菌的单菌落接种于lb液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；
(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mllb液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至od600＝0.6左右；之后加入1m的iptg200μl；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，株不同条件也不同；
(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/ltris·cl(ph调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；
(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；
(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/ltris·cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即sds-page。
9.蛋白电泳检测
电泳：将粗蛋白样品与3x上样buffer按2∶1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10(ml上样，电泳仪设置120v预电泳10-15min，然后进行150v恒压电泳1h。
染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mlsi溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入sii和siii的混合液中(每50mlsii加200(lsiii)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。
表3sds聚丙烯酰氨凝胶制备表
10.序列测定及分析
由美国lcsciences中国公司完成序列测定，用clonemanager、omiga、ncbiblast、dnaman等软件分析序列，结果为seqidno：1。
11.表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力活性测定
称取30g泌乳奶牛新鲜粪便置灭菌培养皿中，加入3ml待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置。将混有待测样品溶液的泌乳奶牛新鲜粪便分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中，对各个孔进行编号，分别编号为1-24，每孔放入0.2g混合物。将3个24孔细胞培养板置于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力。经过7小时的处理，基本可以将混合物中的氨氮清除掉，混合物的除臭能力较强。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。