本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及一种提高植物抗病性的基因及其应用。
背景技术：
目前，对植物中抗病基因的研究主要集中在一类编码含有核苷酸结合位点(nbs)和富亮氨酸重复(lrr)的受体蛋白基因[1-3]。该类基因所编码的nbs-lrr类抗病蛋白作用于植物细胞内，可识别病原菌分泌的效应分子激活植物的防卫反应，从而抑制病原菌的侵染。然而植物中nbs-lrr类抗病蛋白和病原菌效应分子的识别遵循“基因对基因”假说，即nbs-lrr类抗病蛋白只能识别特定的病原菌效应分子。一旦病原菌分泌的效应分子发生变异，nbs-lrr类抗病蛋白对病原菌的抗病功能就会丧失[1-3]。病原菌不同小种分泌的效应分子存在多样性，因而nbs-lrr类抗病蛋白对病原菌的抗病性具有小种专化性。随着田间小种组成的不断变化，在植物中克隆到的大部分编码nbs-lrr类抗病蛋白的基因都已丧失了对疫霉菌的抗病作用。因此，研究开发对疫霉菌具有广谱持久抗病性的基因，是提高作物抗病性的有效途径。
植物中存在大量的细胞膜受体，其结构包括一个胞外域，一个跨膜域和一个胞内域。该类蛋白参与识别侵染过程中病原物或植物所释放的保守的分子模式，激活植物的基础防卫反应，包括：细胞坏死、活性氧迸发、免疫相关基因的表达以及次级代谢产物的合成等[4]。目前在植物中已克隆到几个编码细胞膜免疫受体的基因，例如能够识别细菌的鞭毛蛋白激活植物免疫的fls2[5]。鞭毛蛋白是细菌的重要组分，对病原菌致病性具有重要作用，病原菌很难通过修饰这类保守分子来逃避植物细胞膜受体的识别[6]。因此植物细胞膜免疫受体所介导的植物抗病性具有广谱性和持久性。
大豆(glycinemax)起源于中国，是我国重要的粮油作物之一。大豆根腐病是一种对大豆破坏性极强的病害，其危害面积大、破坏程度重，被列为威胁大豆生产的毁灭性病害之一[7]。大豆根腐病广泛分布于世界主要大豆产区，在全球范围内每年造成的经济损失高达十几亿美元[8]。在我国，大豆根腐病于90年代初在东北地区被发现[9]，现已成为东北、黄淮海大豆生产区和南方菜用豆产区的重要病害之一，严重危胁大豆的生产安全。大豆根腐病主要是由大豆疫霉(phytophthorasojae)侵染引起的，可在大豆的各个生育期造成危害[2]。在环境适宜的情况下，根腐病在被侵染的植株上迅速蔓延，其危害可导致大豆的绝产。因此，改良作物品种抗病性，对有效控制大豆根腐病具有重要的意义。
目前植物中的细胞膜受体对疫霉菌抗病的研究仍处于起步阶段，研究包括大豆在内的植物疫霉菌抗性基因对植物抗病性的研究具有重要意义。
参考文献：
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技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种基因gmlecrk-r。
本发明目的之二在于提供一种含有gmlecrk-r基因的重组表达载体。
本发明目的之三在于提供基因gmlecrk-r的应用。
本发明内容具体详述如下：
本发明提供一种基因gmlecrk-r，该基因来源于大豆，核苷酸序列如seqidno.1所示，或与序列seqidno.1具有70％以上同源性。优选的，核苷酸序列如seqidno.1所示，或与序列seqidno.1具有80％以上同源性，进一步优选的，核苷酸序列如seqidno.1所示，或与序列seqidno.1具有85％以上同源性，更优选的，核苷酸序列如seqidno.1所示，或与序列seqidno.1具有90％以上同源性。
本发明还提供一种基因gmlecrk-r编码的蛋白质。
本发明所述的基因gmlecrk-r编码的蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.2，或seqidno.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提供植物抗病性的由seqidno.2衍生的蛋白质。
利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可设计和人工添加信号肽序列以有利于在植物中的表达。
利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。
本发明还提供一种包括所述基因gmlecrk-r的重组表达载体。
可用现有植物表达载体构建含有所述基因gmlecrk-r的重组表达载体。
现有植物表达载体优选为植物转化质粒，可以为表达载体pbin::egfp、pcambia或ptf101.1等。
优选的，所述的重组表达载体是将基因gmlecrk-r插入到含有c-端egfp的双元载体pbin::egfp酶切位点kpni中得到的载体pbin::gmlecrk-r-egfp。
使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。
含有以上所述基因gmlecrk-r的转基因细胞系及重组菌。
扩增所述基因gmlecrk-r的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记等。
本发明还提供了所述基因gmlecrk-r或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。
本发明还提供了所述基因gmlecrk-r或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在植物提高致病菌免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害中的应用。特别是在植物提高疫霉菌免疫抗性或提高植物抗疫霉菌引起的病害中的应用。
本发明还提供所述基因gmlecrk-r或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在植物育种中的应用。
本发明还提供所述的大豆基因gmlecrk-r或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入植物后获得显著抗病性/或增加产量的品种中的应用，优选导入大豆、烟草、番茄、或马铃薯获得增强抗病性和/或增加产量的品种中的应用。
本发明的有益效果：
本发明所述基因gmlecrk-r编码的蛋白质增强植物对疫霉菌抗病性。在植物中过表达不会影响植物生长性状，尤其对疫霉菌的识别具有广谱性，可以显著增强植物对疫霉菌的抗病性，本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的。
本研究对大豆中细胞膜受体的分析发现gmlecrk-r对大豆疫霉菌和烟草疫霉均具有抗病功能。在过表达gmlecrk-r基因的大豆毛状根上接种大豆疫霉菌，定殖的大豆疫霉菌量显著性减少。gmlecrk-r基因对大豆抗病性起着非常重要的作用，大豆作为一种重要的经济作物和豆科植物的典型代表，对大豆中gmlecrk-r的研究可带动许多其它植物细胞膜凝集素受体蛋白激酶的相关研究。此外在烟草叶片中过表达该基因可显著性增强烟草对烟草疫霉的抗病性，造成的病斑都显著性减小，表明gmlecrk-r对不同疫霉菌具有广谱抗病作用。这些研究将能更好的阐明植物对疫霉菌抗病功能，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。
附图说明
图1pbin::gmlecrk-r-egfp转基因大豆毛状根蛋白表达检测。westernblot检测gmlecrk-r-egfp的表达量，检测抗体为anti-gfp。
图2pbin::egfp和pbin::gmlecrk-r-egfp转基因大豆接种大豆疫霉菌后产生的卵孢子。a，大豆毛状根产生卵孢子的症状。b，大豆毛状根上产生卵孢子的数量统计。
图3pbin::gmlecrk-r-egfp转基因烟草中蛋白表达检测。
图4pbin::egfp和pbin::gmlecrk-r-egfp转基因烟草接种烟草疫霉菌3天后表现的发病症状。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例1.gmlecrk-r基因的克隆与序列结构分析
大豆和丰-47种子直接播于装有营养土的的花盆中，温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)培养，取2周龄植株用于rna的提取。
总rna提取：以大豆叶片为材料，总rna的抽提采用omega公司rna提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其rna含量和质量。
反转录生成第一链：取0.7μgrna作模板，根据takara公司primescript反转录酶配套试剂使用说明进行cdna合成，定容至20ul反应。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆pcr。
以cdna第一链作为rt-pcr模板，常规方法做pcr，扩增gmlecrk-r基因片段或全长基因：
pcr扩增引物序列：
上游引物：seqidno.4
(5’-ttacgaacgatagccggtaccatgtctcattccaaaacccccg-3’)
下游引物：seqidno.5
(5’-gctcaccatcccgggggtaccaaccggaggaggggagggttgc-3’)，
50ul反应体系为，其中5×buffer10ul，2.5mmdntps4ul,takaraprimerstartaq酶0.5ul,模板cdna1ul，加水至50ul；pcr扩增程序为98℃预变性2分钟，98℃变性30秒，58℃退火10秒，72℃延伸2分钟，循环40次，最后72℃延伸10分钟；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(eb)染色照相，记录结果，并切胶回收gmlecrk-rpcr产物。
用agarosegeldnapurificationkit(takara)对电泳条带进行回收。切胶回收的gmlecrk-r的pcr产物根据clonexpressiionestepcloningkit(vazyme)按照说明操作连接到kpni酶切的pbin::egfp载体上得到pbin::gmlecrk-r-egfp质粒，转化大肠杆菌感受态细胞gm109，涂lb(含卡纳50ug/ml)平板，37℃培养16小时后菌落pcr验证挑取三个克隆按照质粒提取试剂盒操作(takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如seqidno.1。测序正确的质粒电击转化到农杆菌k599或gv3101中，涂lb(含卡纳50ug/ml，链霉素50ug/ml)平板，30℃培养48小时后菌落pcr验证挑取正确克隆进行后续实验。
实施例2.大豆根毛中表达gmlecrk-r基因：
具体步骤简述如下：
1)大豆合丰-47的栽种：
将大豆合丰-47的种子均匀播于装有蛭石的花盆中，初期用黑色塑料膜将花盆覆盖或将花盆置于黑暗处培养，待黄化苗均匀长出后，揭开黑色塑料膜，去掉种皮，浇水(约3天到4天)，并置于适宜光照下培养(约1天半到2天)，即六天龄植株的子叶可用于实验。
2)农杆菌培养
分别从平板上挑取转染pbin::gmlecrk-r-egfp载体及pbin::egfp载体的发根农杆菌k599单菌落，分别接种到2mllb液体培养基中(卡纳50ug/ml，链霉素50ug/ml)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的k599发根农杆菌液4500rpm离心3分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mm2-[n-morpholino]ethanesulfonicacid,10mmmgcl2,100μmacetosyringoneph5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液，将菌液od600值调整至0.4。
3)毛状根转化
a,大豆子叶培养基倒平板(ms+20g/l蔗糖+0.8％琼脂+噻孢霉素120ug/ml+羧苄青霉素120ug/ml)。
b,大豆子叶灭菌。在叶柄基部取下大豆子叶，用水冲去表面蛭石后置于灭菌的植物组织培养瓶中，首先用70％酒精灭菌30秒，其次用10％含0.5％有效氯的次氯酸钠浸没灭菌15分钟，最后用灭菌自来水冲洗5遍，将次氯酸钠冲洗干净。
c,大豆子叶创伤。在超净台内戴上无菌手套，用灭菌手术刀切去大豆子叶叶柄部位，并在子叶下表皮中间靠叶柄部位挖出一个伤口。
d,将经过创伤的大豆子叶上表皮朝下贴于培养基放置，用1ml医用注射器在伤口上滴上适量菌液，形成略隆起的小水泡。
e,将培养皿封上封口膜，置于25℃黑暗条件下培养，或者在黑暗和光照交替条件下培养。
4)毛状根的初步鉴定
a,在培养过程中，首先接菌处的伤口会变褐色(两三天)，然后再在中间或者整个伤口生长愈伤组织，愈伤组织呈颗粒状或者连成片状(一周左右开始生长)，愈伤组织需再经过一至两周生长出毛状根。
b,将长出毛状根的子叶置于荧光显微镜下观察，在培养皿上将有绿色荧光的毛状根做好标记。
c,挑出有绿色荧光的毛状根的子叶转接15cm培养皿进行扩大培养，注意观察毛状根的生长状况，待到毛状根长出侧根后即可进行后续实验。
实施例3.疫霉菌的培养
将带有红色荧光的转基因大豆疫霉菌接种到固体v8培养基平板上(g41850ug/ml)，或将烟草疫霉菌接种到固体v8培养基平板上。接种的v8培养基平板置于25℃黑暗条件下培养5天即可用于后续实验。
实施例4.毛状根的侵染
在荧光显微镜下观察经扩大培养后的毛状根，筛选出有绿色荧光的毛状根，用剪刀剪下后置于水中浸泡保湿，并同时洗去毛状根上附着的ms固体培养基。裁取2.5×4.5cm尺寸滤纸浸湿，将滤纸一端平铺于载玻片上，将粗细均匀、生长状况均一的毛状根整齐排列置于滤纸上，将根尖一侧朝向载玻片毛玻璃一侧并让根尖伸出滤纸，尽量保持所有根尖伸出滤纸的距离一致。每片载玻片放置10根左右的毛状根用于侵染。将带有红色荧光的大豆疫霉菌切取尺寸相近的长方形菌丝块，将长有菌丝的一面覆于载玻片上所有毛状根根尖上，用浸湿的滤纸的另一端盖于毛状根上。将所有载玻片置于垫有湿润的15cm圆形滤纸的15cm空培养皿内，放于25℃黑暗条件下培养。取接种大豆疫霉菌侵染2天的大豆毛状根置于荧光显微镜下进行发病症状观察，结果显示疫霉菌侵染在过表达gmlecrk-r的大豆毛状根上产生的卵孢子数量显著减少(图2)，表明过表达gmlecrk-r显著增强大豆对大豆疫霉的抗病性。
实施例5.烟草中过表达egfp和gmlecrk-r-egfp
1)农杆菌的培养
分别从平板上挑取转染pbin::gmlecrk-r-egfp载体及pbin::egfp载体的gv3101单菌落和沉默抑制子p19，分别接种到2mllb液体培养基中(卡纳50ug/ml，利福平50ug/ml)于恒温摇床上30℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的农杆菌液4500rpm离心3分钟收集菌体。用缓冲液(组分：10mm2-[n-morpholino]ethanesulfonicacid,10mmmgcl2,100μmacetosyringoneph5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗3次后，用缓冲液稀释菌液，将含有染pbin::gmlecrk-r-egfp载体及pbin::egfp菌液与p19进行1:1混合至od600值0.6。
2)烟草表达egfp和gmlecrk-r-egfp。将配好的农杆菌用注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)培养。
3)过表达gmlecrk-r-egfp显著性增强烟草对疫霉菌抗病性
注射两天后叶片接种烟草疫霉。在接种3天进行发病症状观察(图4)，照相记录结果。与阴性对照相比，过表达gmlecrk-r-egfp的烟草在接种烟草疫霉菌后出现病斑显著性减小，这些结果证实了过表达gmlecrk-r-egfp显著性提高烟草对不同疫霉菌的抗病性。
实施例6.gmlecrk-r蛋白累计量检测
收集表达gmlecrk-r-egfp的大豆毛状根或烟草叶片进行蛋白累计量的检测。将收集的毛状根或烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：组分为：150mmnacl,50mmtris-hclph7.5,10mmedta(ethylenedia-minetetraaceticacid),1.0％(v/v)np-40,1mmphenylmethylsulfonylfluoride,and1.0％(v/v)proteaseinhibitorcocktail)混匀置于冰上30分钟。18000g离心收集上清液80ul加入20ul5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴10分钟。取20ul样品在sds-page凝胶上进行电泳分离，120v跑胶1.5小时。反应结束后将蛋白样品转到pvdf膜上，用5％pbst牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的gfp一抗(abmart)孵育2小时后用pbst洗膜5分钟三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(li-cor,irdye800,926-32210)孵育30分钟后用pbst洗膜5分钟三次，扫膜结果表明在转基因大豆毛状根和烟草叶片中，lecrk-r-egfp能正常表达合成蛋白(图1和图3)。
综上，可以看出基因gmlecrk-r-egfp对烟草抗疫霉菌具有关键抗病作用。过表达该基因显著性促进烟草对不同疫霉菌的抗病性，是一种理想的增强植物抗病性的基因。通过遗传转化的方法使该基因在烟草中表达使其获得对多种病原菌的抗性能力，从而可以提高作物田间抗病性。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种提高植物抗病性的基因及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2007
<212>dna
<213>大豆和丰-47(hefeng47)
<400>1
atgtctcattccaaaacccccgctgccggcgaaactctattttccggcacggcgttcctg60
attctcctccacctctttctcttccttactcccgcactttcccttgacttcctattcaac120
tccttcgccggcgtcaccaacctcactctcatcaaagacgctcgcgtcgacgcctccgtc180
atccgaatgaacaacgactccaatcagtactcctacggccgcgccttctaccccgtcaaa240
attcccatgctcaaaacaaacacctccaataactcctcttccatttcttccttctccact300
tcctttgtcttctccatcttgccgcagatctctaccagccccggcttcggcctcgccttc360
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<210>2
<211>668
<212>prt
<213>大豆和丰-47(hefeng47)
<400>2
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151015
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354045
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