本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种抗旱转录因子pbrerf109及其制备方法、应用和编码的蛋白质及应用。
背景技术：
植物在其生长周期过程中经常会遇到一些逆境胁迫，包括生物逆境胁迫和非生物逆境胁迫，非生物逆境胁迫主要包括干旱、高温、低温、重金属胁迫等，其中干旱是影响植物的生长发育、产量品质以及限制植物地理分布的重要因素之一。现在清楚的是，植物在干旱胁迫下能够存活，主要依赖于体内的新陈代谢和植株形态上的适应性变化，包括产生一系列生理生化反应从而建立一个系统的防御状态，在多个层次应对干旱胁迫，这一适应过程中许多响应干旱胁迫的基因的表达受到调控(pastoriandfoyer,2002)。人们在鉴定参与逆境响应应答的信号转导元件中已经取得了长足的进步。
目前为止，参与增强植物胁迫抗性或耐受性的许多关键基因得到验证，而这些一般分为两种类型。一类是由直接发挥作用，避免细胞受到胁迫伤害的功能蛋白组成，另一类是由调节信号转导和基因表达过程的调控蛋白组成(chavesetal.,2003；shinozakietal.,2003；yamaguchi-shinozakiandshinozaki,2005；bartelsandsunkar,2005)。在人们研究逆境胁迫的过程中，通过转基因创造出抗性增强的转基因植株是优良的研究材料(wardandschroeder,1994；kleinetal.,2004；shinozakiandyamaguchi-shinozaki,2007)。有研究表明，通过过量表达调节因子和功能基因可以显著提高植物的抗逆性。而功能基因和转录因子在组成性表达的结果会有差异(agarwaletal.,2006)，转录因子在提高植物抗逆性方面的作用要更优于功能基因。一个转录因子会对一系列下游基因的表达水平产生调控作用，从而在多种非生物胁迫(包括干旱)中共同发挥抗逆性(centuryetal.,2008；yangetal.,2011)。因此，转录因子遗传转化是植物抗性遗传改良的一种重要途径和手段。
植物基因组中存在众多的转录因子，erf(ethyleneresponsivefactors，乙烯响应因子)类转录因子是调控网络中不可或缺的重要成员，此类转录因子家族蛋白具有ap2/erf结构域，该结构域是由一个α-螺旋和3条反向平行的β-折叠结构组合而成。α-螺旋通过疏水侧面与dna大沟相互作用使得与dna结合，而β-折叠的作用是识别目的基因的启动子元件，其中第二个β-折叠的第14位和第19位氨基酸残基决定了erf类转录因子的结合体异性(okamuroetal.,1997)。erf转录因子在植物中广泛存在，比如在拟南芥和水稻中分别有147个和157个基因(jofukuetal.,1994；nakanoetal.,2006)。由于erf类转录因子只存在于植物体中，所以对它的研究相对广泛。已有的报道表示，erf转录因子对植物的种子、根、叶和花等器官的生长和发育都有一定的作用(xieetal.,2017)。一些erf蛋白，例如，小麦中病原诱导的erf1基因(tapie1)会响应乙烯信号并激活下游防卫和胁迫相关基因，对植物死体营养型丝核菌(rhizoctoniacerealis)侵染和冷寒胁迫的抵抗性有起到了正向调节的作用(zhuetal.,2014)。乙烯和aba信号可以诱导棉花中的gherf4基因，并在棉花应对非生物胁迫中起到关键作用(jinandliu,2008)。但是现有技术中并未报道erf转录因子能够抗干旱。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗旱转录因子pbrerf109，所述抗旱转录因子pbrerf109能够提高植物的抗旱能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗旱转录因子pbrerf109，具有esqidno.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗旱转录因子pbrerf109编码的蛋白质具有seqidno.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗旱转录因子pbrerf109的制备方法，包括以下步骤：
以梨cdna为模版，用转录因子引物对进行pcr扩增，得到抗旱转录因子pbrerf109；
所述转录因子引物对包括转录因子上游引物和转录因子下游引物，所述转录因子上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述转录因子下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列。
优选的，所述pcr扩增使用的体系每50μl包括：100ng梨cdna、10μlq5reactionbuffer、1μl10mmdntp，0.5μltaq聚合酶、2.5μl10μm转录因子上游引物、2.5μl10μm转录因子下游引物，余量为ddh2o；
所述pcr扩增的条件包括：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；循环完成后72℃延伸2分钟。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗旱转录因子pbrerf109或所述蛋白质在提高植物抗旱能力中的应用。
优选的，所述植物包括烟草或梨。
优选的，当所述植物为烟草时，所述提高烟草的抗旱能力的方法包括以下步骤：
将所述抗旱转录因子pbrerf109与peasy-t1克隆载体进行连接，得到重组载体；
将所述重组载体转入根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；
将所述重组农杆菌侵染烟草。
优选的，所述peasy-t1克隆载体连接的总体系每5μl包括：4μl抗旱转录因子pbrerf109和1μlpeasy-t1克隆载体，所述抗旱转录因子pbrerf109与peasy-t1克隆载体的摩尔比为3:1；
所述连接的条件包括：在25℃下反应30min。
优选的，当所述植物为梨时，所述提高梨的抗旱能力的方法包括：采用瞬时转化方法将所述抗旱转录因子pbrerf109转入到梨中。
本发明提供的抗旱转录因子pbrerf109表达后能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，进而能够提高植株的抗旱能力。
根据本发明实施例的结果显示：本发明将抗旱转录因子pbrerf109转入到烟草和秋子梨中，得到的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢和丙二醛的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小，进而提高了烟草和秋子梨植株的抗旱能力。
附图说明
图1是本发明的技术流程图；
图2是本发明的pbrerf109基因在脱水、脱落酸和4℃低温胁迫下的表达；
图3是本发明的pbrerf109基因亚细胞定位，其中：图3-a，gfp基因(对照)在明场(图中)、紫外线光(图左)下的成像，图(右)为二者叠加后的成像；图3-b，pbrerf109基因在明场(中)、uv光(左)下的成像，图(右)为二者叠加后的成像；
图4是本发明的pbrerf109基因转录激活鉴定，图4pgbkt7tm是空载体转化的酵母在不同培养基上的生长情况；pgbkt7tm-pbrerf109是融合载体转化的酵母在不同培养基上的生长情况；
图5是pcambia1301质粒图谱；
图6是pbrerf109基因的植物超表达载体构建流程图；
图7是pbrerf109转化烟草及植株再生过程示意图；
图8是一种pbrerf109基因转基因植株的pcr鉴定示意图，图8-a利用pbrerf109基因特异引物进行pcr鉴定烟草后t1代转基因植株，m：maker，p：质粒pcambia1301-pbrerf109，wt：野生型植株，1、2、3、……、7、8：转基因株系；图8-b是烟草转基因植株中外源基因pbrerf109的表达量分析，wt为野生型，其它作为转基因系；
图9是本发明中实施例转pbrerf109基因株系(oe5和oe8)及野生型(wt)非转基因植株(wt)干旱处理前后表型和生理指标测定，其中，图9-a是30天大的烟草植株在正常浇水3天和干旱处理20天的表型；图9b-e是30天大的烟草植株在正常浇水3天和干旱处理20天的成活率、失水率、电导率以及叶绿素含量统计；
图10是本发明中实施例转pbrerf109基因株系(oe5和oe8)及野生型(wt)非转基因植株(wt)干旱处理后组织化学染色分析h2o2和o2-积累以及丙二醛含量的测定结果图；图10，a-b是30天大的烟草植株在正常浇水3天和干旱处理20天后未转化植株和两个转基因株系活性氧组织化学染色图，采用二氨基联苯胺和硝基四氮唑分别对h2o2(图10-a)和o2-(图10-b)进行染色；图10-c：为转基因烟草干旱胁迫处理后细胞死亡染色图。图10d是转基因烟草干旱胁迫处理后丙二醛含量测定图。
具体实施方式
本发明提供了一种抗旱转录因子pbrerf109，具有esqidno.1所示的核苷酸序列。在本发明中，所述抗旱转录因子pbrerf109能够提高植物的抗旱能力。在本发明中，所述抗旱转录因子pbrerf109的全长为795bp，包含795bp的开放阅读框，编码264个氨基酸，等电点为5.99，分子量为28.9kda。
在本发明中，所述抗旱转录因子pbrerf109，具有esqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：
atgcccttccatgcgaatcggatacaacaggagcaggagcactgcatcatggtctccgccctcaagcacgtaatctccggtggaagcatcagtgggcccacacctcagccaatgccggcggtctacaatgccacgtcatccgtctcgacgagcggcacccagttggcagcgggccaaccagcacaacaggacaactacttctcgccatcgttgccgaatcaaaacaggaaccagcaactgagtttgggaaccgggtttgtcgggatgaatgcgccaactacgaggaagagcaagaacaagtacaggggcgtcaggcagaggccgtgggggaaatgggcggcggagattcgagacccacgacgggcggcgagggtgtggctagggacgttcgagacggcggaggacgcggccagggcttacgacaaggccgccgtcgagttccgcggaaataaggcaaagctcaatttcccatcggacccgggcggtcacattgtcacgactaacgacagttctagtagtggaactagtgctaatgccagtattaatccaggattaattaataagcaaaagcaaaagaatattagcgaaattggggtcatggagaaggaggaggagaaggttgatcaggtcaaactcaaccaggcgacgcagccggagaatatgcaactgggggtggtggcgaccgcggagagcagcgttggtcatgaggaggatgaccagttcttgttgtgggacaatggctggctccgagatggtgaagatgacgacttaatggcatggttatccacgaactag。
在本发明中，所述抗旱转录因子pbrerf109的制备方法，包括以下步骤：
以梨cdna为模版，用转录因子引物对进行pcr扩增，得到抗旱转录因子pbrerf109；
所述转录因子引物对包括转录因子上游引物和转录因子下游引物，所述转录因子上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述转录因子下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述梨cdna的制备方法优选包括：从杜梨叶片中提取rna，将得到的rna反转录得到cdna。本发明对所述提取rna的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规提取植物rna的方法即可。
在本发明中，所述转录因子pbrerf109优选的来源于杜梨(pyrusbretschneideri)，引物对是根据基因pbrerf109的开放阅读框进行设计得到的。在本发明中，所述所述转录因子上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体如下：
5’－gaagatcttatgcccttccatgcgaatcggata－3’；
所述转录因子下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列，具体如下所示：
5’－gggtnacccctagttcgtggataacca－3’。
在本发明中，所述pcr扩增使用的体系每50μl优选包括：100ng梨cdna、10μlq5reactionbuffer、1μl10mmdntp，0.5μltaq聚合酶、2.5μl10μm转录因子上游引物、2.5μl10μm转录因子下游引物，余量为ddh2o。在本发明中，所述q5reactionbuffe和taq聚合酶优选购买于产地在美国的neb公司。
在本发明中，所述taq聚合酶的酶活优选为1u。
在本发明中，所述pcr扩增的条件优选包括：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；循环完成后72℃延伸2分钟。
本发明还提供了上述技术方案得到的抗旱转录因子pbrerf109或所述的蛋白质在提高植物抗旱能力中的应用。在本发明中，所述具体提高植物抗旱能力的方式为构建转基因植物，将所述抗旱转录因子pbrerf109转入到植物中。
在本发明中，所述植物优选包括烟草或梨，所述梨优选为秋子梨。
在本发明中，当所述植物为烟草时，所述提高烟草的抗旱能力的方法为构建转基因烟草，具体包括以下步骤：
将所述抗旱转录因子pbrerf109与peasy-t1克隆载体进行连接，得到重组载体；
将所述重组载体转入根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；
将所述重组农杆菌侵染烟草。
在本发明中，所述peasy-t1克隆载体连接的总体系每5μl优选包括：4μl抗旱转录因子pbrerf109和1μlpeasy-t1克隆载体，所述抗旱转录因子pbrerf109与peasy-t1克隆载体的摩尔比优选为3:1。
在本发明中，所述连接的条件优选包括：在25℃下反应30min。
本发明对所述载体的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的即可，在本发明实施例中，所述载体为peasy-t1。
本发明对所述重组载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将载体转入根癌农杆菌的方法即可。
本发明对所述重组农杆菌侵染烟草的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规重组农杆菌侵染烟草的方法即可。
在本发明中，当所述植物为梨时，所述提高梨的抗旱能力的方法包括：采用瞬时转化方法将所述抗旱转录因子pbrerf109转入到梨中。
本发明对所述采用的瞬时转化方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的瞬时转化方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗旱转录因子pbrerf109编码的蛋白质具有seqidno.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：
metprophehisalaasnargileglnglngluglngluhiscysilemetvalseralaleulyshisvalileserglyglyserileserglyprothrproglnprometproalavaltyrasnalathrserservalserthrserglythrglnleualaalaglyglnproalaglnglnaspasntyrpheserproserleuproasnglnasnargasnglnglnleuserleuglythrglyphevalglymetasnalaprothrthrarglysserlysasnlystyrargglyvalargglnargprotrpglylystrpalaalagluileargaspproargargalaalaargvaltrpleuglythrphegluthralagluaspalaalaargalatyrasplysalaalavalglupheargglyasnlysalalysleuasnpheproseraspproglyglyhisilevalthrthrasnaspserserserserglythrseralaasnalaserileasnproglyleuileasnlysglnlysglnlysasnilesergluileglyvalmetglulysglugluglulysvalaspglnvallysleuasnglnalathrglnprogluasnmetglnleuglyvalvalalathralagluserservalglyhisglugluaspaspglnpheleuleutrpaspasnglytrpleuargaspglygluaspaspaspleumetalatrpleuserthrasn。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗旱转录因子pbrerf109及其制备方法、应用和编码的蛋白质及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
pbrerf109基因克隆及表达分析
干旱脱水处理下从杜梨叶片抽提rna，反转录获得cdna。本发明在获得所述cnda后，以获得的cdna为模板，并且利用特异性转录因子引物对获得抗旱转录因子pbrerf109，具体序列如seqidno.1所示。
rna提取使用planttotalrnaisolationkitplus(foregene，re-05022)，按照该试剂盒提供的操作说明书操作。第一链cdna的合成用firstscriptstrandcdnasynthesissupermix(transgene，ae301-02)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。
扩增抗旱转录因子pbrerf109的引物对为：正向引物：pbrerf109forward，5’－gaagatcttatgcccttccatgcgaatcggata－3’(seqidno.3)；反向引物：pbrerf109reverse，5’－gggtnacccctagttcgtggataacca－3’(seqidno.4)。
50μl的反应体系中包括100ngcdna，10μl5×缓冲液(q5reactionbuffer)，1μl10mmdntp，0.5μl1utaq聚合酶(q5high-fidelitydnapolymerase)(前述缓冲液和taq聚合酶购自neb公司，美国)，各2.5μl10μm上述正反向引物，taq聚合酶的酶活为1u。pcr反应在veritithermalcycler(applidebiosystem)扩增仪上按以下程序完成：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；循环完成后72℃延伸2分钟。产生一条单一pcr条带产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用
回收纯化的dna溶液与peasy-t1载体(购自全式金公司)进行连接反应，按说明书操作，连接反应体系中插入pbrerf109基因与peasy-t1载体的摩尔比为3:1连接反应总体积是5μl，其中包括4μl纯化的pcr产物，1μlt载体，25℃连接30分钟。
取5μl连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板中筛选阳性克隆，挑取8个克隆测序(由南京一道生物科技有限公司完成)，测序结果表明，本发明克隆pbrerf109基因全长为795bp，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，序列如seqidno.1所示，将这个基因命名为pbrerf109，它包含795bp的编码阅读框，编码264个氨基酸，等电点为5.99，预测分子量为28.9kda。blastx分析该序列与已知的erf109(所有已发表的文献和数据库)序列同源。推导的pbrerf109基因的氨基酸序列与预测的苹果(mderf109，xp_008338309)的序列虽然同源性达85％，但是苹果mderf109这个基因的功能未知。多序列比对结果显示pbrerf109有一段保守结构域，ap2/erf结构域。smart预测氨基酸pbrerf109有1转录激活区域。
为分析pbrerf109基因是否对干旱、脱落酸(aba)、低温处理有所响应，采用实时荧光定量pcr(正向引物pbrerf109-f1：5’－agccggagaatatgcaactg－3’(seqidno.5)；反向引物pbrerf109-r1：5’－tgtcccacaacaagaactgg－3’(seqidno.6))观察该基因在不同胁迫处理下的表达量情况，从而明确何种胁迫对基因pbrerf109诱导最为强烈。采用ctab法提取rna，cdna第一链的合成参照toyobo反转录试剂盒的操作手册进行。在20μl的反应体系中有：10μl2×mix，0.1μlcdna，5μl引物(以tublin为内参引物，长度为208)，4.9μl水。定量pcr的程序如下：
表1定量pcr程序
当对植株进行脱水处理时，如图2a所示，pbrerf109基因的转录水平在植物受到脱水处理后转录水平逐渐上升，在0.5h的时候达到最高，是未处理时的将近4倍，表明了pbrerf109基因对脱水有强烈的响应。当对植株进行脱落酸处理时，如图2b所示，pbrerf109基因的转录水平在植物受到脱落酸处理后转录水平逐渐上升，在1h的时候达到最高，是未处理时的3倍多，表明了pbrerf109基因对脱落酸有强烈的响应。当对植株进行4℃低温处理时，如图2c所示，pbrerf109基因的转录水平6h有缓慢升高，然后逐渐地降低至72h，最后在144h又逐渐升高。从6h到72h没有明显的变化，是未处理的1倍多，说明pbrerf109基因对4℃低温响应不明显。结果表明干旱脱水处理能诱导该基因表达，表明它是一个干旱应答候选基因。
实施例2
pbrerf109基因亚细胞定位、转录激活分析
由于pbrerf109基因是一个转录因子，本发明利用烟草叶肉细胞来研究pbrerf109基因的亚细胞定位。利用rt-pcr扩增出pbrerf109基因整个orf阅读框，并在其扩增引物两端加上xbai和bamhi两个酶切位点。其扩增引物为(正向引物pbrerf109-f2：5’－tctagaatgcccttccatgcgaatcggata－3’(seqidno.11)；反向引物pbrerf109-r2：5’－ggatcccctagttcgtggataacca－3’(seqidno.12))，首先将扩增产物进行酶切。在本发明中所述梨干旱诱导转录因子pbrerf109双酶切的温度为37℃，双酶切的时间为12h；双酶切体系总体积为20μl，包括梨干旱诱导转录因子pbrerf109的pcr的纯化产物10μl，10×g缓冲液2μl，xbai和bamhi各1μl，双蒸水6μl。同时用xbai和bamhi双酶切pcambia1302，回收产物并连接，从而得到pcambia1302-pbrerf109-gfp重组载体，并将其转入农杆菌eha105。农杆菌侵染烟草叶肉细胞按如下方法进行：(1)挑取新鲜培养基上农杆菌单克隆接种于5mllb/kan/rif液体培养基(含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平)，28℃培养1-2天，220rpm/分钟，活化菌液；(2)取活化菌液，50:1接种到50mllb/kan/rif液体培养基中(含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平)，28℃培养8～12小时，220rpm/分钟，培养期间检测菌液od600介于0.6到0.8之间；(3)将菌液转移至50ml离心管中，4000rpm/分钟，离心5分钟，去掉上清；(4)加入10ml清洗液(10mmmes+10mmmgcl2)重悬菌体，4000rpm/分钟，离心5分钟，去上清，再用5ml清洗液重复一次，最后加入3ml清洗液，充分吸打混匀；(5)吸取重悬菌液，19:1加入清洗液中，测定od600；(6)注射液为5ml/组合，调整两种菌液的终浓度od600约为0.6，最后用清洗液补足至5ml，加入5μl乙酰丁香酮(acetosyringone，as)，混匀后，常温放置2-3小时，等待注射；(7)将侵染液装入注射器(5ml)内，一个组合注射2-3片叶，叶片随机选取分布于不同植株上，架取大小适中的叶片，按压注射器将液体注射到烟草叶片下表皮内；(8)注射完毕后，将烟草放置于25℃下培养，48-72小时；(9)分别向两者的叶片注射4’,6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，随后用激光共聚焦显微镜(zeisslsm710，德国)观察报告基因定位情况，结果表明，对照载体转化时整个细胞中均有荧光，结果见图3a，而重组载体转化的细胞中荧光只能在细胞核特异染料dapi的染色区域检测到，结果见图3b，说明pbrerf109是一个核定位蛋白。
实施例3
植物转化超表达载体构建
根据pcambia1301载体的多克隆位点(图5)和pbrerf109基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择bglii和bsteii作为内切酶。首先将以pbrerf109基因的克隆子为模板进行pcr扩增(扩增引物对正向引物：pbrerf109forward，5’－gaagatcttatgcccttccatgcgaatcggata－3’(seqidno.3)；反向引物：pbrerf109reverse，5’－gggtnacccctagttcgtggataacca－3’(seqidno.4))，然后将pcr产物连同pcambia1301载体一起在37℃下进行酶切，酶切2～3h后纯化回收。在连接反应体系中加入pbrerf109基因与载体pcambia1301的物质的量的比率为3:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer1μl，t4dna连接酶1μl，双酶切回收的pbrwrky53基因4ul，双酶切回收的pcambia1301载体产物2μl，双蒸水2μl，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌菌株dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板中筛选，挑选单克隆pcr检测呈阳性后抽提质粒进行酶切，测序确定序列无误后，即pcambia1301-pbrerf109重组载体构建成功。应用冻融法将重组载体导入根癌农杆菌gv3101中并保菌。植物超表达载体‘pcambia1301-pbrerf109’的构建流程如图6所示。
实施例4
烟草遗传转化
根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：
1.农杆菌培养：取新鲜活化的农杆菌菌液，在添加了50mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平lb固体平板上划线，2天后用灭菌枪头刮取平板上的菌落，放入液体ms中，28c°，200转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到od600＝0.4～0.6时结束培养，然后用于浸染；
2.浸染：取健康的未转基因的野生型烟草叶片，切成方形，尺寸大小约为0.5公分长宽，将其用镊子放入培养好的gv3101农杆菌菌液中，淹没浸泡10分钟左右，培养期间放于28℃、200rpm摇床不断振荡；
3.共培养：同镊子轻轻取出于ms中浸染后的叶片，用经过无菌处理的滤纸吸干表面多余的菌液，然后夹取叶片(叶表面朝上)放置于共生培养基上，25℃暗处理供培养72小时；
4.筛选培养：取出经过暗培养叶片，夹取叶片放入已配制好的头孢霉素溶液中浸泡，冲洗一遍，然后用无菌水对该叶片漂洗4次，用无菌滤纸吸干表面残余水分，最后再把叶片(叶表面朝下)放置于含有20mg/l潮霉素和500mg/l头孢霉素的ms培养基中；
5.生根培养：烟草叶片会在筛选培养基上长出不定芽，待目测估计不定芽长约至1公分时，将不定芽切下后，并用镊子小心放入含有20mg/l潮霉素、500mg/l头孢霉素以及0.5mg/l6-ba的ms培养基上；
6.烟草苗移栽：观察该转基因烟草苗长势到一定程度时，将其用镊子夹取茎部，从生根培养基中抽离出，用水冲洗干净转基因烟草苗根部的ms培养基，并在混有蛭石的无菌营养土以及干净的穴盆里进行移栽，从而得到转pbrerf109基因烟草植株。
实施例5
梨瞬时转化
瞬时转化梨干旱诱导转录因子pbrerf109的秋子梨株系的制备，具体方法如下：
1.选取在人工气候室中生长5周左右的秋子梨(pyrusussuriensis)用于农杆菌侵染。
2.于lb培养基(含50mg/lkanamycin+100mg/lrifampicin+50mg/lgentamycin)划线培养带有目的质粒的gv3101农杆菌，挑取农杆菌克隆于5mllb培养基中28℃培养过夜。
3.测定农杆菌菌液od600值之后，3000rpm离心10min收集菌液，弃上清。用乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液[10mmmes(ph5.6)+10mmmgcl2+200umacetosyringone]悬浮，调整至od600大约为1.5左右，室温静置3h。
4.将含有目的质粒的农杆菌用于秋子梨叶片的注射。
5.用1ml注射器(去掉针头)，在梨叶片背面注射，标记好注射过的叶片。
6.将注射过的梨植株放回人工气候室培养6-7天，即可观察瞬时转化的结果。
实施例6
转基因植株的分子鉴定
1、叶片dna提取
取适量转基因烟草植株叶片放入1.5ml离心管中，加入液氮，充分研磨到成粉末状；立即在已研磨成粉末的离心管内加入700μl65℃预热的dna提取液十六烷基三乙基溴化铵，提取液配方：100mmtris-hcl(ph8.0)，1.5mnacl，50mmedta(ph＝8.0)，1％聚乙烯吡咯烷酮，2％ctab；将混合了提取液的叶片粉末放入65℃水浴锅温浴90分钟，每隔15分钟拿出颠倒混匀；温浴后，10000g常温离心10分钟，取上清液，加入600μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5分钟；10000g离心15分钟，取上清液，2倍体积预冷的无水乙醇，34μl5mnacl溶液，颠倒混匀后，放入-20℃冰箱静置30分钟；10000g离心10分钟，取上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀3次，空管离心一分钟，吹干酒精，直至dna呈无色透明状，加适量无菌双蒸水，放置于37℃培养箱中溶解40min，于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
2、半定量rt-pcr检测pbrerf109基因的超表达
本研究采用半定量rt-pcr分析转基因梨及烟草植株中外源基因pbrerf109的表达量，转基因株系叶片rna提取与cdna合成的方法同实施例1。半定量所用引物为pbrerf109基因特异引物(正向引物pbrerf109-f1：5’－agccggagaatatgcaactg－3’(seqidno.5)；反向引物pbrerf109-r1：5’－tgtcccacaacaagaactgg－3’(seqidno.6))。反应程序为94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。转基因烟草外源基因表达量采用半定量pcr分析，转基因烟草分析用ubiqutin做内参，引物序列为：正向引物ubiqutin-f：5’－tggcggacgggtgagtaacgcg－3’(seqidno.7)；反向引物ubiqutin-r：5’－gctggtccggtgggataccctcc－3’(seqidno.8)。转基因梨分析用tublin做内参，正向引物tublin-f：5’－tgggctttgctcctcttac－3’(seqidno.9)；反向引物tublin-r：5’－ccttcgtgctcatcttacc－3’(seqidno.10)。结果表明，在转基因株系中的pbrerf109基因的表达量均比野生型高，选择亮度高的5和8，即表达量高的两个超表达株系命名oe5和oe8作为单独的转基因株系，然后分别作为收种子的母本植株。
实施例7
转基因植株的抗性评价
同批收的烟草未转化植株(wt)和转pbrerf109超表达系(oe5、oe8)将wt、oe5和oe8在ms生长培养基上生长15天后移栽到盆中生长20天后，正常生长的植株没有差别，但在干旱处理处理20天后，wt植株萎蔫程度严重，而oe5和oe8植株仍能正常生长，表明转基因植株的抗旱能力明显比野生型强(图9a)。统计成活率，结果表明，两个转基因系的成活率明显高于野生型(图9b)。图9(c、d)分别表示测定干旱处理后植株的失水率和电导率，结果显示转基因植株的失水速率以及电导率明显低于野生型。图9e是室温下干旱处理20天后叶绿素测定、及叶绿素提取。上述研究表明转pbrerf109基因的烟草植株抗旱能力比未转化植株(wt)明显增强。
在转基因株系中，电导率较低和成活率高表明他们可能具有比wt有更强的抗ros的能力。那么通过鉴定植株中ros的积累量便成为必要。用dab和nbt组织化学染色法对植株叶片进行染色，分别用来检测过氧化氢(h2o2)及超氧阴离子(o2-)的含量。如图10(a,b)干旱胁迫20天之后，用dab染色的叶片，野生株系型出现褐色的叶面积明显比转基因株系要大，且颜色更深，用nbt染色的叶片，野生型株系比转基因株系的蓝色更深，面积更大。同样的，如图10(c,d)所示转基因超表达株系中丙二醛(mda)的含量以及细胞死亡程度均要比野生型要低，细胞损伤更小。这些证据表明，表明转基因系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，进而表明，过表达的pbrerf109基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。
为了评估pbrerf109转基因梨超表达对干旱的抗性，正常生长情况下，对照及超表达系形态没有明显的差异，在干旱处理20天后，发现野生型比转基因系萎蔫更严重且呈水渍状；恢复浇水生长7天，转基因的两个系恢复快而对照极大部分不能恢复正常生长变成枯黄，且顶芽已经死亡。上述研究结果表明，转基因系的抗旱能力比野生型强。
由以上实施例可以得出，本发明将抗旱转录因子pbrerf109转入到烟草和秋子梨中，得到的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢和丙二醛的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小，进而提高了烟草和秋子梨植株的抗旱能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种抗旱转录因子pbrerf109及其制备方法、应用和编码的蛋白质及应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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