本发明涉及抑藻剂领域，具体地说是一种海藻附生真菌来源的胡萝卜烷倍半萜类化合物及其制备方法和在抑制微藻方面的应用。
背景技术：
世界范围内，近海赤潮灾害日益频发，严重阻碍海洋渔业、近岸旅游和海洋经济的发展。2000年以后我国进入赤潮高发期，赤潮发生频率和危害程度明显增加。赤潮的主要危害形式有四种，一是破坏海洋生态平衡；二是破坏海洋渔业资源；三是危害人类健康；四是影响海洋旅游业的发展。据统计，每年由赤潮造成的经济损失高达10亿元以上。海洋中可引发赤潮的微藻约有300种，其中有毒赤潮藻约80种。科学有效地预防和治理赤潮是当今世界性难题之一。
目前，赤潮的防治对策除了防止海水富营养化外，还要遏制赤潮生物即赤潮藻的发展，而遏制赤潮藻发展的方法主要为化学药剂治理。虽然化学药剂如硫酸铜、氯气等快速、有效地杀死或抑制有害藻类或抑制其生长繁殖，但存在对非赤潮生物的危害、药物残留以及对环境的二次污染等问题。
与治理赤潮中使用的传统的化学药剂相比，海洋生物源天然药物具有针对性强、安全性高、活性显著且对环境友好的优点，为解决目前由赤潮藻引发的赤潮的防治问题提供了新的思路。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种胡萝卜烷倍半萜类化合物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种胡萝卜烷倍半萜类化合物，胡萝卜烷倍半萜类化合物结构如式(i)所示
一种胡萝卜烷倍半萜类化合物的制备方法，将绿木霉(trichodermavirens)y13-3接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式(i)所示的胡萝卜烷倍半萜类化合物；所述的绿木霉(trichodermavirens)y13-3于2018年1月10日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccno:m2018016；
具体制备步骤：
1)将绿木霉(trichodermavirens)y13-3接种于真菌培养基中发酵10-60天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层层析分离纯化，即得如式(i)所示的胡萝卜烷倍半萜类化合物。
所述步骤1)中真菌培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基、大米固体培养基、麦芽汁培养基或菊芋葡萄糖液体培养基；优选为：马铃薯葡萄糖液体培养基。
有机溶剂提取液为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种；优选为：乙酸乙酯。
所述步骤2)中的有机溶剂为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
所述步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；薄层层析展开剂为体积比为10-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇或二氯甲烷-乙酸乙酯。
所述步骤3)各层析后经tlc检测，均收集红色斑点的组分。
一种胡萝卜烷倍半萜类化合物的应用，所述的胡萝卜烷倍半萜类化合物在用于制备微藻的抑藻剂中的应用。
所述微藻为引起海洋赤潮的海洋卡盾藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻或剧毒卡尔藻。
本发明具有以下优点：本发明通过分离于海洋红藻真江蓠表面的绿木霉(trichodermavirens)y13-3发酵经提取、分离获得的胡萝卜烷倍半萜类化合物，经抑制微藻活性实验得出化合物对能引起赤潮的海洋卡盾藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻和剧毒卡尔藻的半数抑制浓度分别为0.24,3.8,3.1和5.2微克/毫升。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
海藻附生真菌来源的胡萝卜烷倍半萜类化合物结构如式(i)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状；比旋光度[α]20d–114(c0.13,meoh)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代氯仿)δh2.29(d,16.1),2.25(d,16.1),2.41(dd,12.0,3.7),2.61(m),2.51(dddd,20.1,7.1,3.7,0.9),6.43(dq,7.1,1.4),2.84(d,15.7),2.64(d,15.9),1.78(heptet,6.9),0.97(d,6.9),0.91(d,6.8),1.89(brs),1.02(s)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代氯仿)δc36.4(c),54.1(ch2),218.5(c),81.2(c),48.6(ch),28.4(ch2),139.3(ch),137.3(c),201.3(c),57.8(ch2),36.7(ch),16.8(ch3),17.2(ch3),22.2(ch3),20.2(ch3)；高分辨质谱[m]+m/z250.1570,计算值250.1569。
实施例2
如式(i)所示的胡萝卜烷倍半萜类化合物的制备方法：
取平板上生长良好的绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种，切成小块并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共200瓶，室温静止发酵30天，而后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物27.2克。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基组成为每升含100克土豆的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉5克，陈海水500毫升。
绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种于2018年1月10日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉大学，保藏编号为cctccno:m2018016,分类命名为trichodermavirens，株号为y13-3。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯以体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1到1:1和二氯甲烷-甲醇20:1、10:1、5:1到1:1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，收集的各组分再用薄层层析(tlc)检测(体积比20-0：1的石油醚-乙酸乙酯展开，茴香醛-硫酸作为显色剂),根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得10个组分(1-10)。
将rf值为0.6-0.7(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)的组分5，即以体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱、sephadexlh-20凝胶柱和薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的水-甲醇，tlc检测(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经sephadexlh-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇，tlc检测(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集rf值为0.6－0.7的组分，即为式(i)所示化合物(6.2毫克)，经tlc检测(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，呈单个、均匀红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种新的胡萝卜烷倍半萜类化合物，结构式如(i)所示。
实施例3
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种，切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共100瓶，室温静止发酵40天，过滤并分别收集菌丝体和发酵液。
所述菊芋葡萄糖液体培养基组成为每升含100克菊芋块茎的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉5克，陈海水500毫升。
收集发酵液约30升，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体干燥并粉碎后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩；浓缩物经薄层层析(tlc)检测(体积比20-0：1石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物18.0克。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用石油醚-乙醇以体积比50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(体积比20-0：1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色),根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。
将rf值为0.6-0.7(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)的组分3即以体积比15:1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱、sephadexlh-20凝胶柱和薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的水-乙醇，tlc检测(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经sephadexlh-20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，tlc检测(体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比10:1的石油醚-乙醇为展开剂，收集rf值为0.6－0.7的组分，得式(i)所示胡萝卜烷倍半萜类化合物。
实施例4
抑微藻活性实验：
具体为:活化供试微藻，取对数生长期的微藻，用已灭菌的f/2培养基，稀释至一定的藻细胞浓度(约5×104个/毫升)，取96孔板，每孔加95微升藻液为测试培养板。样品组和对照组各设三个平行，样品组加含浓度为4毫克/毫升的式(i)所示化合物的5微升二甲基亚砜(dmso)溶液，空白对照组加5微升二甲基亚砜(dmso)，阳性对照组加5微升浓度为4毫克/毫升的k2cr2o7溶液。培养温度20℃，光照强度2000lux，光暗比14:10(小时)条件下，培养24小时。其中供试微藻为海洋卡盾藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻或剧毒卡尔藻。
利用血球计数板，在显微镜下对各实验组中微藻进行计数；而后将上述抑制率大于50％的实验组，进一步计算其半数抑制浓度ic50值。将配置好的终浓度为4毫克/毫升的式(i)所示化合物dmso溶液依次经dmso进行稀释，最终得到11组浓度依次降低的组分(2000、1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1微克/毫升)。观察并计算各浓度梯度下化合物的微藻抑制率，取抑制率在0-100之间至少5个浓度梯度，计算ic50值。
实验结果：上述获得的胡萝卜烷倍半萜类化合物对海洋卡盾藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻和剧毒卡尔藻的半数抑制浓度分别为0.24微克/毫升、3.8微克/毫升、3.1微克/毫升和5.2微克/毫升，具有抑制海洋卡盾藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻或剧毒卡尔藻的作用。