本发明涉及一种花青素苷元的制备方法，特别涉及一种吡喃型花青素苷元的制备方法。
背景技术：
近年来，随着我国食品工业的迅猛发展，食品色素产业也逐渐发展壮大起来。由于人工合成色素稳定性好、着色力强，人工合成色素在很大范围内主宰了我国食品色素的市场。但由于合成色素一般带有一定的毒性，甚至具有致癌作用，相比之下，天然色素具有安全性高、营养价值高等优点，随着人们对食品安全的重视，天然色素有望逐渐代替人工合成色素，研究、开发无毒无害的天然色素已经成为食品色素产业发展的趋势。花青素作为一种天然食用色素，因其来源丰富、安全无毒，在食品色素应用领域中已展现出良好的发展势头；此外，国内外众多研究报道表明，花青素具有抗氧化、抗炎症、抗癌、抗血脂、改善视力等多种功能活性，在保健食品、医药、化妆品、生物工程及化工领域有着更广泛的应用前景。但由于花青素存在稳定性较差，对光、热、金属、ph值均较为敏感，从而导致其应用受到了严重限制。如何提高花青素的稳定性，已经成为科研人员的面临的迫切任务。
自然条件下游离的花青素形式极为少见，花青素主要以糖苷衍生物形式(花色苷)存在于水果或蔬菜等植物中，如花青素糖基化、酰基化形式，已知天然存在的花色苷有500余种。吡喃型花青素(pyranoanthocyanins)为一种新型花青素衍生物，主要存在于发酵后的果酒或果汁中，是在原有花青素的c4与c5位的羟基间经环化加合反应新增一个吡喃环，形成的一种更加稳定的花青素构型。天然存在的吡喃型花青素较为少见，现已发现的吡喃型花青素主要源于葡萄酒中，如甲基型、羧基型、酚基型、黄烷醇型、portisins型吡喃花青素。与普通构型的花青素相比，吡喃型花青素因在c4及c5位羟基间形成了新的吡喃型，可以直接保护花青素分子受到水或so2的亲核攻击，使得吡喃型花青素对ph及so2有着更强的耐受力，鉴于吡喃型花青素的较高的稳定性，其在食品、药品及化妆品等领域将展现出巨大的应用潜力。
目前，国内外市场上已存在多款花青素产品，如提取物、软胶囊、口服液、补水面膜等不同形式的花青素产品。随着研究的不断深入，将有更多花青素的产品走向市场。通过对市面的花青素产品进行分析，我们发出现几乎所有花青素产品均属于花青素的糖苷形式(花色苷)。到目前为止，国内外市场上尚无吡喃型花青素产品的出售，开发高稳定性、高活性的吡喃型花青素产品具有极大的市场潜力和应用空间。近年来，已有部分文献报道了吡喃型花青素的制备方法，如以陈酿后的葡萄酒为原料，经过分离纯化手段制备吡喃型花青素，或以葡萄皮花青素提取物为原料，通过化学合成及分离纯化手段制备吡喃型花青素。通过查阅专利技术，国内仅有1项相关专利报道，如中国专利(专利名称：一种甲基吡喃花色苷的制备方法及其应用，申请号：cn201610556696.5)涉及了一种吡喃花青素的制备方法，该方法以花青素标准品(矢车菊素－3－o－葡萄糖苷)为原料，与一定量的丙酮混合后，经过超声波处理，静置30天后，再经过层析柱分离，进而制得甲基吡喃花色苷。该方法与已有的技术相比，合成甲基吡喃花色苷的速率较快，且产率高、产品纯度高，为一种有前景的制备甲基吡喃花色苷的方法。但由于这种方法依赖于花青素标准品原料的限制，且反应周期近1个月左右，反应周期较长，不适合大规模的制备吡喃花青素产品，所得样品无法直接应用于食品、医药等领域。此外，该方法所制得的甲基吡喃花青素为糖苷形式。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有的制备方法不适合大规模的制备吡喃花青素产品，所得样品无法直接应用于食品、医药等领域的问题而提供的一种吡喃型花青素苷元的制备方法。
本发明提供的吡喃型花青素苷元的制备方法，其制备方法如下所述：
步骤一、提取：将蓝莓果实原料经破碎后制成匀浆，以1：3-1：5的体积比向果实匀浆中加入60-80％的乙醇溶液，调节ph值为1.0-3.0，搅拌0.5小时后，于室温下闭光浸泡24-72小时；滤出提取液，残渣再进行提取2-3次；
步骤二、萃取：将减压浓缩后的提取液用乙酸乙酯进行液液萃取，体积比按提取液：乙酸乙酯为1：2-1：4，于室温下闭光萃取2-3次，时间为24小时/次，收集水层花青素部分备用；
步骤三、柱层析：将步骤二中制得的水层花青素部分装入大孔树脂柱，单次上样体积为树脂体积的1/8-1/12，先用去离子水冲洗柱子，再用浓度35-45％的含0.01-0.05％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集35-45％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素纯化液；
步骤四、酸水解：将步骤三中制得的蓝莓花青素纯化液与2.5-4.0mol/l盐酸溶液按体积比1：4-1：8混匀，并加入10-20％的无水乙醇，于95-100℃下水浴加热1-1.5小时，取出后迅速冷却室温，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元水解液；
步骤五、柱层析：将步骤四中制得的花青素苷元水解液上固相萃取小柱或上大孔树脂柱，上样量为柱体积的1/3-1/5，先用去离子水进行洗脱，洗脱3-5倍柱体积，再用浓度60-80％的含0.01-0.05％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集60-80％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元纯化液；
步骤六、化学合成：将步骤五中制得的蓝莓花青素苷元纯化液与50-80％的丙酮水溶液按体积比1:30-1:50混匀，并加入10-20％的无水乙醇，用盐酸调节反应溶液ph值范围在1.5-4.5间，于30-55℃下水浴加热3-8天，反应结束后，反应液经减压浓缩，干燥后，制得纯度为60-70％的吡喃型花青素苷元。
步骤一中所述的蓝莓果实原料是由蓝莓鲜果或蓝莓冻果或蓝莓果粉或蓝莓果渣制成。
步骤二至步骤六中的减压浓缩的条件为：温度范围40-55℃，真空度<0.09mpa，浓缩后终体积达为原溶液体积的1/5-1/10。
步骤三和步骤五中所用大孔树脂的型号为amberlitexad-7hp、ab-8、nka-9和d101中的一种；步骤五中所述的固相萃取小柱的型号为sep-pakc18。
步骤六中干燥形式为真空冷冻干燥，干燥条件为：温度范围-45℃至-55℃，真空度<50pa，时间24-48h。
步骤四与步骤六中所涉及的酸水解步骤应优先于化学合成步骤，二者先后顺序不可颠倒。
本发明的有益效果：本发明提供的吡喃型花青素苷元的制备方法以蓝莓果实为原料，在先后制得花青素糖苷、花青素苷元的基础上，合成了吡喃型花青素苷元，吡喃型花青素苷元的化学结构及制备过程具体如下：
由于目前国内仅有针对吡喃型花青素糖苷的报道，尚未有针对吡喃型花青素苷元的文献或发明专利的报道，深入研究或开拓吡喃型花青素苷元的潜在功能及应用价值具有重要意义。
本发明所制得的吡喃型花青素苷元产品，既保留了原有花青素的多种功效(如抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等)，又比原有花青素在稳定性上有显著的提高，如更耐中性或弱碱性ph环境，对so2有更强的耐受作用，可以扩大花青素在食品、药品、化妆品、化工等领域的应用。
附图说明
图1为本发明所述蓝莓花青素经酸水解后制得花青素苷元的高效液相色谱图。(图中1-5号分别为：1，飞燕草素；2，矢车菊素；3，牵牛花素；4，芍药色素；5，锦葵色素)。
图2为图1中1号峰对应单体(飞燕草素)的紫外可见光谱图。
图3为图1中2号峰对应单体(矢车菊素)的紫外可见光谱图。
图4为图1中3号峰对应单体(牵牛花素)的紫外可见光谱图。
图5为图1中4号峰对应单体(芍药色素)的紫外可见光谱图。
图6为图1中5号峰对应单体(锦葵色素)的紫外可见光谱图。
图7为本发明所述蓝莓花青素苷元经化学合成制得的吡喃型花青素苷元的高效液相色谱图。(图中1-5号分别为：1，吡喃型飞燕草素；2，吡喃型矢车菊素；3，吡喃型牵牛花素；4，吡喃型芍药色素；5，吡喃型锦葵色素)
图8为图7中1号峰对应单体(吡喃型飞燕草素)的紫外可见光谱图。
图9为图7中2号峰对应单体(吡喃型矢车菊素)的紫外可见光谱图。
图10为图7中3号峰对应单体(吡喃型牵牛花素)的紫外可见光谱图。
图11为图7中4号峰对应单体(吡喃型芍药色素)的紫外可见光谱图。
图12为图7中5号峰对应单体(吡喃型锦葵色素)的紫外可见光谱图。
图13为图7中1号峰对应单体(吡喃型飞燕草素)的高效液相色谱-质谱图。
图14为图7中2号峰对应单体(吡喃型矢车菊素)的高效液相色谱-质谱图。
图15为图7中3号峰对应单体(吡喃型牵牛花素)的高效液相色谱-质谱图。
图16为图7中4号峰对应单体(吡喃型芍药色素)的高效液相色谱-质谱图。
图17为图7中5号峰对应单体(吡喃型锦葵色素)的高效液相色谱-质谱图。
具体实施方式
请参阅图1至图17所示：
实施例1
步骤一、提取：将冷冻蓝莓果实原料经破碎后制成匀浆、加入带盖玻璃容器中，以1：5的体积比向蓝莓果实匀浆中加入70％的乙醇溶液，用盐酸调节ph值在3.0，搅拌0.5小时后，于室温下闭光浸泡72小时；滤出提取液，残渣再进行提取2次；
步骤二、萃取：将减压浓缩后的提取液倒入分液漏斗中，用乙酸乙酯进行液液萃取，体积比按提取液：乙酸乙酯为1：2，于室温下闭光萃取3次，时间为24小时/次，每次先将酯层经上方倒出，再将水层由下方收集备用；
步骤三、柱层析：将水层部分花青素萃取溶液通过湿法装入amberlitexad-7大孔树脂柱，单次上样体积为树脂体积的1/10，先用0.01％盐酸酸化的去离子水冲洗柱子，用于除去样品中还原糖、蛋白、有机酸等水溶性的杂质，洗脱5倍柱体积后，再用浓度40％的含0.01％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集40％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素纯化液。
步骤四、酸水解：将蓝莓花青素纯化液与3.0mol/l盐酸溶液与按体积比1：5在带盖玻璃容器中混匀，并加入10％的无水乙醇，配制成反应溶液，置于100℃的水浴锅中分反应1小时，取出后迅速冷却室温，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元水解液。
步骤五、柱层析：将花青素苷元水解液上sep-pakc18固相萃取小柱用于去除苷元水解液中的过量盐酸及生成的还原糖类，上样量为柱体积的1/5，先用0.01％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱4倍柱体积，再用浓度70％的含0.01％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元纯化液，高效液相色谱检测结果见图1，所得苷元样品中不同单体的紫外可见光谱分析结果见图2至图6。
步骤六、化学合成：将蓝莓花青素苷元纯化液与60％的丙酮水溶液按体积比1:40在带盖玻璃容器中混匀，并加入10％的无水乙醇，配制成反应溶液，用盐酸调节反应溶液ph值范围在3.0，于40℃水浴加热7天，反应期间每天搅拌3次，利用高效液相色谱法(480nm)监测反应过程，反应结束后，减压浓缩，干燥后，制得吡喃型花青素苷元，经高效液相色谱法测得其纯度为67.5％，获得样品的高效液相色谱检测结果见图7，所得吡喃样品中不同单体的紫外可见光谱分析结果见图8至图12，所得单体的高效液相色谱-质谱检测结果见图13至图17。
实施例2
步骤一、提取：将新鲜蓝莓果实原料经破碎后制成匀浆、加入带盖玻璃容器中，以1：3的体积比向蓝莓果实匀浆中加入65％的乙醇溶液，用盐酸调节ph值在2.5，搅拌0.5小时后，于室温下闭光浸泡48小时；滤出提取液，残渣再进行提取3次；
步骤二、萃取：将减压浓缩后的提取液倒入分液漏斗中，用乙酸乙酯进行液液萃取，体积比按提取液：乙酸乙酯为1：3，于室温下闭光萃取3次，时间为24小时/次，每次先将酯层经上方倒出，再将水层由下方收集备用；
步骤三、柱层析：将水层部分花青素萃取溶液通过湿法装入ab-8大孔树脂柱，单次上样体积为树脂体积的1/12，先用0.03％盐酸酸化的去离子水冲洗柱子，用于除去样品中还原糖、蛋白、有机酸等水溶性的杂质，洗脱5倍柱体积后，再用浓度35％的含0.03％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集35％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素纯化液；
步骤四、酸水解：将蓝莓花青素纯化液与2.5mol/l盐酸溶液与按体积比1：4在带盖玻璃容器中混匀，并加入20％的无水乙醇，配制成反应溶液，置于95℃的水浴锅中分反应1.5小时，取出后迅速冷却室温，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元水解液；
步骤五、柱层析：将花青素苷元水解液上ab-8大孔树脂，用于去除苷元水解液中的过量盐酸及生成的还原糖类，上样量为柱体积的1/5，先用0.03％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱4倍柱体积，再用浓度80％的含0.03％盐酸的乙醇溶液洗脱，收集80％的乙醇洗脱液，减压浓缩，制得蓝莓花青素苷元纯化液；
步骤六、化学合成：将蓝莓花青素苷元纯化液与70％的丙酮水溶液按体积比1：50在带盖玻璃容器中混匀，并加入20％的无水乙醇，配制成反应溶液，用盐酸调节反应溶液ph值范围在3.5，于45℃水浴加热5天，反应期间每天搅拌3次，利用高效液相色谱法(480nm)监测反应过程，反应结束后，减压浓缩，干燥后，制得吡喃型花青素苷元，经高效液相色谱法测得其纯度为62.8％。