本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法。
背景技术：
兔产品的生产和贸易是畜牧业的重要组成部分。我国家兔出栏、存栏和兔肉产量分别占全球的40％、25％和41.09％。兔出血症(俗称兔瘟)是威胁兔群生命和健康的常见疾病，其对兔产品的生产构成严重影响。自然条件下，该病主要危害2月龄以上成年兔。其以呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血和肝坏死为主要病变特征。其呈暴发性流行，具有潜伏期短、发病急、病程短(家兔通常于感染后48～72h死亡)、传播快、死亡率高(80％～100％)。兔出血症于1984年被我国首次报道后，在世界很多国家出现发病和流行的报道，严重威胁着世界养兔业的健康发展，已被我国列为出入境检验检疫二类动物疫病。
兔出血症的病原体为兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)，为单链正股RNA病毒，在分类上应归属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。除经典毒株外，兔出血症病毒存在变异型a(Antigenic variant of rabbit hemorrhagic disease virus，RHDVa)。经典RHDV与RHDVa具有相同的基因组结构，全长约为7400碱基，含有2个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，其中ORF1起始于5’′端，占全长的94％，ORF1编码1个蛋白，该蛋白后续形成成熟的非结构性蛋白和1个主要的结构蛋白－VP60衣壳蛋白，非结构蛋白在病毒基因组依次排列为p16，p23/p26，2C-like，p29，p13/p14，3C-like，p58(RNA依赖的RNA聚合酶，RdRP)。VP60蛋白变异性是病毒基因型分类的依据，也是病毒免疫保护性抗原。ORF2位于3’′端，编码VP10蛋白，是病毒粒子的次要结构蛋白。
在兔养殖过程中，能否有效控制兔病，包括兔出血热症，在很大程度上取决于及时、准确监控兔病的流行趋势。经典RHDV与变异型RHDVa在流行病学特性上有很大的差异。相较于经典RHDV，变异型RHDVa更容易在高密度饲养的兔群体中传播。但是，我国兔业主要生产经营模式呈现多样化的特征，集约化大规模生产模式，合作组织生产模式以及农户庭院生产模式并存。虽然产业升级、规模化标准化养殖成为趋势，但是，分散的小规模由于其具有的优势，如投资少、见效快，也会有较快发展。上述生产方式无疑为不同的RHDV的传播提供了有利外部环境，也对及时、准确诊断和防控兔出血症的爆发提出了挑战。
目前，针对兔出血症病毒的分子检测方法，主要涉及RT-PCR技术以及荧光RT-PCR技术：
(1)PCR技术特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，在DNA聚合酶的参与下，完成对特定基因的体外复制。
(2)作为PCR技术的发展，荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监测荧光信号的强度，结合相应的软件对产物进行分析，从而达到对产物进行定量的目的。
目前建立的多种兔出血症病毒的分子检验方法，在疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但是，这些均将经典兔出血症病毒与兔出血症病毒变异型a作为单一目标进行检测。而且，PCR反应的特异性主要依赖于引物与靶序列的特异性结合，由于病毒自身的遗传变异特征，上述方法面临假阴性或假阳性的风险。针对PCR的检验结果，如需进一步确认，则需要测定产物的核酸序列，导致检验周期与费用的增加；荧光定量PCR虽然能够通过使用特异性探针或者对PCR扩增曲线的比较提高检验的可靠性，但是，其结果依然依赖于引物与靶序列的特异性结合，仍无法避免假阴性或假阳性结果的风险，且该方法操作复杂，试剂费用昂贵，需要专用实验设备。针对我国当前及今后仍将广泛存在的分散农户的小规模养殖模式，上述方法都会增加农户的经济负担。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法。该PCR引物及其试剂盒特异性好，灵敏且准确，无需大型仪器设备或后续测序验证，节省费用；操作简便且快速。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测经典兔出血症病毒(RHDV)和兔出血症病毒变异型a(RHDVa)的PCR引物，由经典兔出血症病毒检测引物和兔出血症病毒变异型a检测引物组成；
经典兔出血症病毒检测引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；
兔出血症病毒变异型a检测引物由SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物组成。
本发明专利的目的是提供特异性强、可靠性高的检测和鉴别经典兔血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒变异型a(RHDVa)的PCR引物。经典兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)与兔出血症病毒变异型a(Antigenic variant of rabbit hemorrhagic disease virus，RHDVa)具有较高的遗传相似性，但在流行病学方面呈现一定程度的差异。本发明要解决的技术问题是建立一种能够检测和鉴别经典兔出经典血症病毒与兔出血症病毒变异型a的分子诊断方法及其试剂盒。该方法应具有特异性高、费用低廉且操作便捷快速的特点。在生产应用方面，本方法能够通过一次采样、一次分析即可获得结果，费用低廉且操作便捷快速。
本发明还提供了一种同时检测经典兔出血症病毒和兔出血症病毒变异型a的RT-PCR试剂盒，包括逆转录体系、PCR体系，PCR体系包括如权利要求1的PCR引物。
本发明专利的另一个目的是提供特异性强、费用低廉的可检测和鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型RT-PCR的检测试剂盒。
作为优选，逆转录体系包括RNA PCR缓冲液、dNTP、RNase-free ddH2O、MgCl2、RNase抑制剂、AMV逆转录酶、随机引物和病毒RNA。
作为优选，以10μL计，逆转录体系为：
作为优选，PCR体系还包括Taq DNA聚合酶缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶和逆转录产物。
作为优选，以50μL计，PCR体系为：
作为优选，该试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
本发明还提供了一种非诊断目的同时检测经典兔出血症病毒和兔出血症病毒变异型a的方法，包括如下步骤：
提取样品RNA；
配制逆转录体系，进行逆转录，得到逆转录产物；逆转录体系包括RNA PCR缓冲液、dNTP、RNase-free ddH2O、MgCl2、RNase抑制剂、AMV逆转录酶、随机引物和RNA；
配制PCR体系，进行PCR扩增，PCR体系包括本发明提供的引物(经典兔出血症病毒检测引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；兔出血症病毒变异型a检测引物由SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物组成)，将扩增产物进行电泳，检测经典兔出血症病毒和兔出血症病毒变异型a是否存在；PCR体系还包括Taq DNA聚合酶缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶和逆转录产物。
作为优选，逆转录的反应程序为：
作为优选，PCR扩增的反应程序为：
经典兔出血症病毒检测引物：
兔出血症病毒变异型a检测引物：
作为优选，检测经典兔出血症病毒和兔出血症病毒变异型a是否存在具体为：
(1)经典兔出血症病毒PCR扩增产物的大小为170bp，兔出血症病毒变异型a PCR扩增产物的大小为167bp；
(2)在(1)的基础上，通过综合分析两组PCR反应产物的有/无，排除结果的假阴性和假阳性，即
本发明提供了一种同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法。该PCR引物由经典兔出血症病毒检测引物和兔出血症病毒变异型a检测引物组成；经典兔出血症病毒检测引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；兔出血症病毒变异型a检测引物由SEQ ID NO：3所示的上游引物和SEQ ID NO：4所示的下游引物组成。本发明具有的技术效果为：
(1)特异性：通过遗传序列的特征，设计特异性的引物，可以检测并清晰鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型a，有利于准确诊断疫病的病原体类型；
(2)灵敏且准确：通过PCR反应，可大量扩增目的片段，且可通过综合分析两组PCR反应的结果，排除了诊断结果的假阴性和假阳性；
(3)无需大型仪器设备或后续测序验证，节省费用；
(4)操作简便且快速：本方法通过一次采样、一次分析即可获得可靠结果，且用时短。
附图说明
图1示针对引物组RH-FP+RH-RP对经典兔瘟病毒具有良好的扩增效率，而在同样的条件下，兔出血症病毒变异型a的样品则没有产物生成；
图2示针对引物组RHa-FP+RHa-RP对兔出血症病毒变异型a具有良好的扩增效率，而在同样的条件下，经典兔瘟病毒的样品则没有产物生成。
具体实施方式
本发明公开了一种同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
RHD：Rabbit hemorrhagic disease，兔出血症，兔瘟；
RHDV：Rabbit hemorrhagic disease virus，兔出血症病毒；
RHDVa：Antigenic variant of rabbit hemorrhagic disease virus，兔出血症病毒变异型；
PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应；
RT-PCR：Reverse transcription PCR，逆转录-聚合酶链式反应。
本发明每组引物的下游引物的靶序列在经典兔血症病毒和兔出血症病毒变异型a内部，其均呈现较为保守的特征，遗传变异较小；但在两型病毒之间，该序列则存在明显分化。本发明引物特异性好，操作简单且费用低廉。基于两组RT-PCR的实验结果，通过简单的比较，即可准确检测和鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型a，可有效避免排除了诊断结果的假阴性和假阳性，且耗时短、费用低廉。
本发明提供的同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
采用靶序列(M67473与DQ280493的VP60 1099-1103nt)设计下游引物。使上述序列位于引物的3’端，使其对于产物的特异性产生明显的影响。对应于靶序列的上述特征，引物序列的差异将导致不同类型兔出血症病毒的PCR的结果呈现明显分化。引物如表1所示：
表1经典兔血症病毒(RHDV)和兔出血症病毒变异型a(RHDVa)检测、鉴定引物
注：A，腺嘌呤；C，胞嘧啶；G，鸟嘌呤；T，胸腺嘧啶。简并碱基R，A或G；W，A或T；Y，C或T。
本实施例还提供了可检测和鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型a的PCR检测试剂盒。
除上述引物，本检测试剂盒还包括：逆转录酶、聚合酶以及反应缓冲溶液。
可同时检测和鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型a的PCR检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品的RNA；
(2)配制RT-PCR反应液；
(3)以步骤(1)获取的RNA作为模板，以上述2组引物分别采用一步法RT-PCR方法进行PCR反应；
(4)结果判定标准：参见表2。
表2RT-PCR一步法检测和鉴别经典兔血症病毒(RHDV)和兔出血症病毒变异型a(RHDVa)的结果判定标准
具体步骤如下：
(1)RHDV RNA的提取与RT反应
按照RNAiso Plus reagent说明书操作提取RHDV人工感染组织病料中总RNA(保存于-70℃)为模板，根据RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1(DRR012A)说明书进行反转录(RT)。
反应体系(10μL)：
反应程序为：
收集RT产物保存于-70℃备用。
(2)本发明PCR方法的优化
为建立一个敏感且稳定的PCR方法，本实施例对PCR反应的参数进行了优化，包括退火的温度。
PCR反应体系(50μL)为：
反应条件为：
反应结束后取5μL产物进行琼脂糖凝胶(10g/L)电泳分析。
(3)实验结果
PCR检测结果显示，引物组RH-FP+RH-RP和引物组RHa-FP+RHa-RP均表现出良好的扩增效果和特异性。
针对引物组RH-FP+RH-RP对经典兔瘟病毒具有良好的扩增效率，而在同样的条件下，兔出血症病毒变异型a的样品则没有产物生成(图1)。
针对引物组RHa-FP+RHa-RP对兔出血症病毒变异型a具有良好的扩增效率，而在同样的条件下，经典兔瘟病毒的样品则没有产物生成(图2)。
(4)扩增产物的鉴定
回收阳性产物条带送至华大-六合测序公司进行序列测定。测序结果与NCBI已有兔瘟病毒序列比对，确定其分别为经典兔瘟病毒和兔出血症病毒变异型a。
上述实例结果说明本发明所述PCR检测方法具有特异性好，操作简单的特性，仅通过简单的比较，即可准确检测和鉴别经典兔血症病毒与兔出血症病毒变异型a，可有效避免排除了诊断结果的假阴性和假阳性，且耗时短、费用低廉。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种同时检测RHDV和RHDVa的PCR引物及其试剂盒和非诊断目的检测方法
<130> MO180147
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gccaatgctg ggtctgca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tgcacagtcg twacgttg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgctgggtc tgcaattg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ctgcacagty gtrgcagc 18