本发明属于SNP分子标记技术领域，具体涉及一种用于检测不结球白菜抗根肿病的SNP分子标记及其应用。
背景技术：
传统系谱法选育方法是不结球白菜育种家们普遍采用的育种方法，通过育种家们多年的努力，培养和创制了大量的优质、高产和抗病的不结球白菜新品种。然而，结合表型鉴定的传统育种模式存在表型把控不准、遗传群体需求量大、人力成本高、育种周期长等缺陷，很难实现大规模商业化集成育种或是材料遗传育种的改良。伴随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助育种选择(Molecular Assisted Selection,MAS)显示了巨大的技术优势，实现了遗传基础与目标现状的有效结合，选择含有目标基因的材料(单株)进行配组，实现了目标性状的精准改良，能有效回避传统育种方法的技术壁垒。
单个核苷酸变异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)插入或是缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的SNP分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能SNP标记，将性状与基因型相关联，进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于SNP标记的检测手段主要是凝胶电泳、荧光定量PCR和竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)。本发明所开发的标记适用于KASP方法检测SNP位点，该方法已经陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。
根肿病是由芸苔根肿菌(plasmodiophora brassicae Woron)侵染引致的十字花科作物根部病害，传染性极强，能随种子、肥料、雨水、灌溉水、虫害、鼠害、农事操作等多种途径传播，病原菌在土壤或种子上越冬，可在土壤中存活10年以上，病菌在9～23℃均可发育，土壤含水量70％～90％最易发病。根肿菌侵染植株后首先影响根毛的发育，几周后进入根的外皮层和中柱细胞，在这个过程中根肿菌在细胞内繁殖，导致根组织异常增生，在增生部位膨大形成瘤状的肿根，肿根的出现影响根系水分、物质和能量的运输能力，受侵染的植物生长发育迟缓，使植株萎蔫、黄化和落叶，甚至整株死亡。不结球白菜是上海、长江中下游及以南地区，人们每日必食的、不可缺少的大众化蔬菜。近年来，不结球白菜根肿病的发病趋势越来越严重，给种植户造成了巨大的经济损失。根肿病的发病受到环境因素较大，且进行田间和室内鉴定费时费力，鉴定后的基质处理也给环境和根肿病菌的二次传播带来问题，因此，开发适用于苗期高通量鉴定不结球白菜植株与抗根肿病性状紧密连锁的SNP分子标记，有助于快速、有效地检测不结球白菜对根肿病的抗性，有助于大规模的商业化分子育种，具有良好的应用前景和经济价值。
技术实现要素：
本发明的目的是，提供一种用于检测不结球白菜抗根肿病的SNP分子标记及其应用。
本发明为上述目的所采用的技术方案如下：
一种用于检测不结球白菜抗根肿病的SNP分子标记，所述SNP分子标记为Br_K_070103，该Br_K_070103位于不结球白菜第7号染色体第201813113位碱基处，该处碱基为G的不结球白菜表现为抗病，该处碱基为T的不结球白菜表现为感病。
所述SNP分子标记Br_K_070103，其序列为：gacaaaatcataaatactacgtaagcttcaaatatggtaacatgcggaaarcaacaaaaacgtataaatgcatagatatgtaaagatttttgttattatta(如SEQ ID NO.1所示)。其中，第51nt位点处的碱基r为T或G。本发明经群体实验证实，上述分子标记与不结球白菜抗根肿病的性状紧密相关，所检测的2个亲本及其F2群体中，亲本材料CR38在Br_K_070103测试位点的碱基型为G:G，表现为抗病，CS22测试位点的碱基型则为T:T，表现为感病，285个F2群体单株种，有93个单株检测到G:G，有54个单株检测到中T:T，均表现为纯合型；有138个单株检测到中G:T，表明为杂合型。
本发明还提供用于检测所述SNP分子标记的特异性引物组合，包括：
(1)两条特异引物PrimerX和PrimerY：引物PrimerX的序列如SEQ ID NO.2所示，引物PrimerY的序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)一条通用引物PrimerC：其序列如SEQ ID NO.4所示。
所述两条特异性引物的核苷酸序列和通用引物序列见表1。
表1 标记引物序列表
本发明还提供所述特异性引物组合在检测不结球白菜品种抗根肿病性状中的应用。具体包括如下步骤：
(1)提取待测不结球白菜基因组DNA；
(2)以不结球白菜基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物组合进行KASP反应检测，在两条特意性引物PrimerX和PrimerY的5’-端分别连接FAM-tail:5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(SEQ ID NO.5所示)和VIC-tail:5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(SEQ ID NO.6所示)通用荧光标签序列；
(3)检测不结球白菜品种抗根肿病性状时，若只检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号，则待测不结球白菜表现为抗根肿病；若只检测到引物PrimerX所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测待测不结球白菜为不抗病材料；若同时检测到两者荧光则判断不结球白菜为抗根肿病的杂合型。
优选地，在进行不结球白菜育种时，选择检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号的不结球白菜样品进行育种。
所述荧光序列可为本领域常规使用的荧光序列，优选两个荧光颜色差异大的荧光序列。在本发明中的一个具体实施方式中，选择使用FAM和VIC荧光序列分别连接在两条特异性因的5’端。
优选地，所述步骤(2)中KASP检测中的PCR条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环。
本发明还提供了所述的特异性引物组合用于检测所述SNP分子标记的方法，该方法为：
利用权利要求2所述的特异性引物组合对待检测不结球白菜的基因组DNA进行KASP检测，在引物PrimerX和引物PrimerY的5’-端分别连接不同的通用荧光标签序列；若只检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号，则待测不结球白菜为抗根肿病材料，其基因型为G，若只检测到引物PrimerX所连荧光序列的荧光信号，则判定待测不结球白菜为不抗根肿病的材料，其基因型为T；若同时检测到两种荧光，则判定不结球白菜样品为携带抗根肿病性状的杂合型。
本发明还提供了包含所述特异性引物组合的试剂盒。
本发明还提供了所述试剂盒在不结球白菜种质资源改良中的应用。
本发明还提供了所述试剂盒在培育抗根肿病不结球白菜中的应用。
上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，PCR反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)SNP位点的筛选与构建的群体有关、与遗传效应值有关。在筛选过程中如果位点不明显，则需要重新构建群体材料再进行筛选。本发明发明人通过大量实验探索分析，构建获得合适的群体材料，然后进一步构建抗感病基因池进行基因组的重测序，再进行BSA定位分析，最终获得可用于检测不结球白菜抗根肿病性状的SNP分子标记。
(2)提供了上述SNP分子标记在不结球白菜育种中的检测，利用该分子标记及检测方法，选择与抗根肿病紧密连锁的分子标记，可以用于不结球白菜抗根肿病的鉴定及辅助选择育种，对促进抗根肿病的分子育种具有重要意义。
(3)本发明应用KASP技术对所找到的SNP分子标记进行基因分型，可以快速、准确的检测不结球白菜对根肿病的抗性，大幅提高遗传转育效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，便于操作，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染，以及对人体的危害。
附图说明
图1为本发明实施例应用BSA-seq方法在不结球白菜7号染色体上定位抗根肿病QTLs的示意图，其中黑色横线qBrCR38-07代表定位区间。
图2为本发明与不结球白菜抗根肿病紧密连锁的SNP标记在群体中的基因分型测试图；其中T:T为抗病基因型，G:G为感病基因型，G:T为杂合型，NTC为无模板对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所试验点实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。实施例中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
实施例1与不结球白菜抗根肿病性状连锁的SNP分子标记的开发
利用室内鉴定获得的抗7号生理小种根肿菌的不结球白菜材料自交系CR38为母本，感病自交系CS22为父本，通过杂交、自交得到F2分离群体285个单株，通过室内人工鉴定，根据植株根系感染根肿病的大小，将植株发病等级分为0级(不发病)、1级、2级和3级。F2群体的285个单株的发病情况为：0级80株，1级143株，2级40株和3级22株，将F2群体发病等级为0级(未发病植株)的22个单株构建极端抗病基因池CR-pool，发病等级3级的22个单株构建感病基因池CS-pool进行基因组的重测序，然后进行BSA定位分析，定位到1个QTL命名为qBrCR38-07在第7号染色体区域18M-21M的区域。参见图1，该图为应用BSA-seq方法在不结球白菜7号染色体上定位抗根肿病QTLs的示意图，其中黑色横线qBrCR38-07代表定位区间。
在此目标区域根据亲本多态性SNP位点第201813113位碱基处序列进行引物设计。本发明设计的用于检测上述SNP分子标记的引物组合为：
(1)两条特异性引物：
PrimerX：5’-gaaggtgaccaagttcatgctaatatggtaacatgcggaaag-3’；
PrimerY：5’-gaaggtcggagtcaacggattaatatggtaacatgcggaaat-3’。
(2)一条通用引物
PrimerC：5’-tgcatttatacgtttttgttg-3’。
在两条特意性引物5’-端分别连接FAM-tail:5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’和VIC-tail:5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’通用荧光标签序列；对待测的不结球白菜进行KASP反应检测。
实施例2开发的SNP分子标记的KASP反应的检测
1、针对本发明所述的分子标记设计引物，利用KASP反应可高通量的对不结球白菜抗根肿病性状进行检测，采用实施例1设计的引物组合。
2、采用简化CTAB法，从不结球白菜叶片中提取基因组DNA。
(1)取适量不结球白菜叶片鲜样或冻样，放入2ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；
(2)加入750μL CTAB溶液，震荡均浆，65℃震荡温浴0.5-1h；
(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μL氯仿：异戊醇你(24：1)电刀3-4次混匀；
(4)12000rmp离心10min，取上清液500μL至新的1.5mL离心管中；
(5)加入等体积异丙醇溶液轻轻摇均，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心3min，弃上清液；
(6)加入1mL 70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；
(7)加入300mL H2O,溶解备用。
3、KASP反应测试：
KASP反应测试在LCG SNPline基因分析平台上进行。在微孔板反应板中加入1.0-1.5μL的20ng/μL DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar。结果参见图2，为与不结球白菜抗根肿病紧密连锁的SNP标记在群体中的基因分型测试图；其中G:G为抗病纯合基因型，A:A为感病纯合基因型，A:G为杂合型，NTC为无模板对照。图2结果显示分型效果良好。
表2 抗根肿病的SNP分子标记PCR扩增反应体系
实施例3：F2分离群体抗病性鉴定及分子标记与表型相关性分析
对本发明中的标记进行表型验证，具体步骤如下：
1、将含有7号生理小种的肿根打碎与灭菌基质混匀，根肿菌浓度为5×106孢子/g，将种子播种到混合基质中进行接种，室内温度25/20℃(白天/夜晚)，光周期14h/10h(白天/夜晚)，根据植株根系感染根肿病的大小对每个单株发病情况进行调查、评价不结球白菜根肿病的发病轻重程度：
0级—未发病；
1级—主根未发生明显肿大，须根、侧根有个别细小肿瘤
2级—主根明显肿大，肿瘤大小达茎基部横切面积的2～3倍；
3级—主根明显肿大，肿瘤大小达茎基部横切面积的4倍以上，或主、须呈现多个明显肿瘤。
2、根据调查的发病等级计算亲本的病情指数(DSI)Suwabe(2003)。参见表3，为亲本及F2群体的发病情况。利用室内获得的抗根肿菌7号生理小种的的不结球白菜自交系CR38(2016年和2017年的DSI是3.33和4.76)，易感病自交系CS22(在2016年和2017年的DSI是100.00和94.44)。以CR38为母本杂交、自交得到F2分离群体285个单株。F2群体的285个单株的发病情况为：0级80株，1级143株，2级40株和3级22株。
表3 亲本及F2群体的发病情况鉴定
3、参照实施例2中的方法，检测供体抗性亲本CR38与受体感病材料CS22，杂交的F2分离群体单株抗感根肿病的表型结果如表4。F2分离群体单株表型鉴定结果与基因分型结果高度对应，在F2群体中与抗病亲本CR38的纯合基因型G:G一致的有31株0级，49株1级，7株2级，7株5级；与感病亲本CS22纯合基因型T:T一致的有13株0级，21株1级，12株3级，8株5级，T:G碱基型为杂合型植株共138株。
4、对F2群体的基因型和表型相关性验证结果进行t-test分析，结果为p＝0.008(p<0.05)，显示Br_K_070103标记与不结球白菜根肿病抗病性紧密相关。
表4 Br_K_070103标记在F2分离群体检测结果
本发明涉及不结球白菜抗感根肿病材料的SNP分子标记，该标记位于根据位于第7号染色体第201813113位碱基处，该SNP分子标记多态性为T/G。本发明提供了用于检测该SNP位点的特异性引物组合和检测方法，所述特异性引物组合分别如表1所示。本发明的SNP分子标记可用于不结球白菜抗根肿病的预测，可以用于筛选和鉴定自然遗传材料是否具有抗根肿病的性状。本发明提供的检测方法准确可靠，操作简便，适用于高通量商业化分子育种的应用，为不结球白菜抗根肿病品种的选育或改良提供了科学依据。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种用于检测不结球白菜抗根肿病的SNP分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 不结球白菜(Brassica rapa)
<400> 1
gacaaaatca taaatactac gtaagcttca aatatggtaa catgcggaaa rcaacaaaaa 60
cgtataaatg catagatatg taaagatttt tgttattatt a 101
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc taatatggta acatgcggaa ag 42
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat taatatggta acatgcggaa at 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcatttata cgtttttgtt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21