本发明属于SNP分子标记技术领域，具体涉及一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用。
背景技术：
传统系谱法选育方法是黄瓜育种家们普遍采用的育种方法，通过育种家们多年的努力，培养和创制了大量的优质、高产和抗病的黄瓜新品种。然而，结合表型鉴定的传统育种模式存在表型把控不准、遗传群体需求量大、人力成本高、育种周期长等缺陷，很难实现大规模商业化集成育种或是材料遗传育种的改良。伴随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助育种选择(Molecular Assisted Selection,MAS)显示了巨大的技术优势，实现了遗传基础与目标现状的有效结合，选择含有目标基因的材料(单株)进行配组，实现了目标性状的精准改良，能有效回避传统育种方法的技术壁垒。
单个核苷酸变异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)插入或是缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的SNP分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能SNP标记，将性状与基因型相关联，进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于SNP标记的检测手段主要是凝胶电泳、荧光定量PCR和竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)。本发明所开发的标记适用于KASP方法检测SNP位点，该方法已经陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。
白粉病(Powdery mildew，PM)俗称白毛，是一种广泛发生的世界性病害。病原菌主要通过气流传播，具有潜育期短、再侵染频繁、流行性强等特点。北方病菌以闭囊壳随病残体留在地上或温室、塑料大棚瓜类作物上越冬。南方病菌以菌丝或分生孢子在寄主上越冬或越夏，成为翌年初侵染源。在我国，春保护地和夏秋露地黄瓜每年都因白粉病的发生造成大量损失，白粉病能在整个黄瓜生育期发病，主要危害叶片，严重的危害茎蔓，特别是在生长中后期发病严重，使植株提早拉秧，造成严重减产。在上海及南方地区的保护地栽培中，这两种病的危害越来越严重。长期的阴雨潮湿栽培环境下，田间通风不良、光照不足、植株长势弱、湿度增高有利于病原白粉菌的大量发生。目前生产上主要是用药物防治的方法来防治病害的发生，但是污染环境，农药残留，影响果实品质，危及食品安全，同时增加种植户成本。长期施药又会对病原菌的生理小种产生抗性，从而增加防治难度，因此，只有培育抗白粉病的黄瓜品种，才能从根本上解决黄瓜无公害生产的问题。在育种过程中进行田间和室内鉴定费时费力，因此，开发适用于苗期高通量鉴定黄瓜植株与抗白粉病性状紧密连锁的SNP分子标记，有助于快速、有效地检测黄瓜对白粉病的抗性，有助于大规模的商业化分子育种，具有良好的应用前景和经济价值。
技术实现要素：
本发明的目的是，提供一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用。
本发明为上述目的所采用的技术方案如下：
一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于黄瓜第4号染色体，关联区域在NCBI编号NC_026660.1的片段上，命名为qCSSL-04，起始位置22.3Mb，终止位置23.1Mb，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，其中第51nt位点处的碱基r为A或G，该位点碱基为G的黄瓜表现为抗病，碱基为A的黄瓜表现为感病。
所述SNP分子标记CS_K_040108，其序列如下：taactccaactactctcttttcagttcttt tcatttcccaaacactaccartctcatctgtcaaacaaattgggcatataatgagtattgacagtagagta，其中第51nt位点处的碱基r为A或G。本发明经群体实验证实，上述分子标记与黄瓜抗白粉病的性状紧密相关，所检测的2个亲本及其F2群体中，亲本材料SL02在CS_K_040108测试位点的碱基型为G:G，表现为抗病，XL01测试位点的碱基型则为A:A，表现为感病，215个F2群体单株中，有4个单株检测到G:G，有17个单株检测到A:A，均表现为纯合型；有158个单株检测到A:G，表明为杂合型。
本发明还提供用于检测所述SNP分子标记的特异性引物组合，包括：
(1)两条特异引物CS_K_040108X和CS_K_040108Y：CS_K_040108X的序列如SEQ ID NO.2所示，CS_K_040108Y的序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)一条通用引物CS_K_040108C：其序列如SEQ ID NO.4所示。
所述两条特异性引物的核苷酸序列和通用引物序列见表1。
表1标记引物序列表
本发明还提供所述的特异性引物组合在检测黄瓜品种抗白粉病性状中的应用。具体包括如下步骤：
(1)提取待测黄瓜基因组DNA；
(2)以黄瓜基因组DNA为模板，利用所述特异性引物组合进行KASP反应检测，在两条特异性引物CS_K_040108X和CS_K_040108Y的5’-端分别连接FAM-tail:5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(SEQ ID NO.5所示)和VIC-tail:5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(SEQ ID NO.6所示)通用荧光标签序列；
(3)检测黄瓜抗白粉病性状时，若只检测到引物CS_K_040108Y所连荧光序列对应的荧光信号，则待测黄瓜表现为抗白粉病；若只检测到引物CS_K_040108X所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测黄瓜为不抗病材料；若同时检测到两者荧光则判断黄瓜为抗白粉病的杂合型。标记与白粉病抗病性的相关程度进行test检验为极显著(p<0.05)
优选地，在进行黄瓜育种时，选择检测到引物CS_K_040108Y所连荧光序列对应的荧光信号的黄瓜样品进行育种。
所述荧光序列可为本领域常规使用的荧光序列，优选两个荧光颜色差异大的荧光序列。在本发明中的一个具体实施方式中，选择使用FAM和VIC荧光序列分别连接在两条特异性因的5’端。
优选地，所述步骤(2)中KASP检测中的PCR条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环。
本发明还提供了所述的特异性引物组合用于检测所述SNP分子标记的方法，该方法为：
利用所述特异性引物组合对待检测黄瓜的基因组DNA进行KASP检测，在引物CS_K_040108X和引物CS_K_040108Y的5’-端分别连接不同的通用荧光标签序列；若只检测到引物CS_K_040108Y所连荧光序列对应的荧光信号，则待测黄瓜为抗白粉病材料，其基因型为G，若只检测到引物CS_K_040108X所连荧光序列的荧光信号，则判定待测黄瓜为不抗白粉病的材料，其基因型为A；若同时检测到两种荧光，则判定黄瓜样品为携带抗白粉病性状的杂合型，标记与白粉病抗病性的相关程度进行test检验为极显著(p<0.05)。
本发明还提供了包含所述的特异性引物组合的试剂盒。
本发明还提供了所述的试剂盒在黄瓜种质资源改良中的应用。
本发明还提供了所述的试剂盒在培育抗白粉病黄瓜中的应用。
上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，PCR反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)SNP位点的筛选与构建的群体有关、与遗传效应值有关。在筛选过程中如果位点不明显，则需要重新构建群体材料再进行筛选。本发明发明人通过大量实验探索分析，构建获得合适的群体材料，然后进一步构建抗感病基因池进行基因组的重测序，再进行BSA定位分析，最终获得可用于检测黄瓜抗白粉病性状的SNP分子标记。
(2)提供了上述SNP分子标记在黄瓜育种中的检测，利用该分子标记及检测方法，选择与抗白粉病紧密连锁的分子标记，可以用于黄瓜抗白粉病的鉴定及辅助选择育种，对促进抗白粉病的分子育种具有重要意义。
(3)本发明应用KASP技术对所找到的SNP分子标记进行基因分型，可以快速、准确的检测黄瓜对白粉病的抗性，大幅提高遗传转育效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，便于操作，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染，以及对人体的危害。
附图说明
图1为本发明实施例应用BSA-seq方法在黄瓜第4号染色体上定位抗白粉病QTLs的示意图，其中黑色横线代表定位区间。
图2为本发明与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记在群体中的基因分型测试图；其中G:G为抗病纯合基因型，A:A为感病纯合基因型，A:G为杂合型，NTC为无模板对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所试验点实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。实施例中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
实施例1与黄瓜抗白粉病性状连锁的SNP分子标记的开发
利用室内鉴定获得的抗白粉病的黄瓜自交系SL02为母本，感病自交系XL01为父本，通过杂交、自交得到F2分离群体215个单株，通过室内人工鉴定，根据植株叶片白粉病病斑的多少，将植株发病等级分为0级(不发病)、1级、3级和5级。F2群体的215个单株的发病情况为：0级40株，1级93株，3级65株和5级17株，将F2群体发病等级为0级(未发病植株)的17个单株构建极端抗病基因池R-pool，发病等级5级的17个单株构建感病基因池S-pool进行基因组的重测序，然后进行BSA测序定位分析，定位到第4号染色体区域22.3M-23.1M的区域。参见图1，该图为应用BSA-seq方法在黄瓜第4号染色体上定位抗白粉病QTLs的示意图，其中qCSSL-04黑色横线代表定位区间。
在此目标区域根据亲本多态性SNP位点第23159853位碱基处序列进行引物设计。本发明设计的用于检测上述SNP分子标记的引物组合为：(1)两条特异性引物：
CS_K_040108X:
gaaggtgaccaagttcatgcttttcatttcccaaacactaccag；
CS_K_040108Y:
gaaggtcggagtcaacggattttcatttcccaaacactaccaa。
(2)一条通用引物
CS_K_040108C：tgcccaatttgtttgacaga。
在两条特异性引物5’-端分别连接FAM-tail:5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’和VIC-tail:5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’通用荧光标签序列；对待测的黄瓜进行KASP反应检测。
实施例2开发的SNP分子标记的KASP反应的检测
1、针对本发明所述的分子标记设计引物，利用KASP反应可高通量的对黄瓜抗白粉病性状进行检测，采用实施例1设计的引物组合。
2、采用简化CTAB法，从黄瓜叶片中提取基因组DNA。
(1)取适量黄瓜叶片鲜样或冻样，放入2ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；
(2)加入750μL CTAB溶液，震荡均浆，65℃震荡温浴0.5-1h；
(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μL氯仿：异戊醇你(24：1)电刀3-4次混匀；
(4)12000rmp离心10min，取上清液500μL至新的1.5mL离心管中；
(5)加入等体积异丙醇溶液轻轻摇均，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心3min，弃上清液；
(6)加入1mL 70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；
(7)加入300mL H2O，溶解备用。
3、KASP反应测试：
KASP反应测试在LCG SNPline基因分析平台上进行。在微孔板反应板中加入1.0-1.5μL的20ng/μL DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。结果参见图2，为与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记在群体中的基因分型测试图；其中G:G为抗病纯合基因型，A:A为感病纯合基因型，A:G为杂合型，NTC为无模板对照。图2结果显示分型效果良好。
表2抗白粉病的SNP分子标记PCR扩增反应体系
实施例3：F2分离群体抗病性鉴定及分子标记与表型相关性分析
对本发明中的标记进行表型验证，具体步骤如下：
1、用悬浮孢子液(浓度1×104～1×106个/ml)在温度25℃白天/20℃夜晚，湿度80％环境下接种黄瓜幼苗叶片，将黄瓜幼苗第2片和第3片真叶为对象，根据叶片上病斑面积的大小，对每个单株发病情况进行调查、评价黄瓜白粉病的发病轻重程度：
0级—未发病，高抗；
1级—病斑占叶片面积约30％；
3级—病斑占叶片面积约70％；
5级—病斑占叶片面积约100％。
2、根据调查的发病等级计算亲本的病情指数(DSI)。参见表3，为亲本及F2群体的发病情况。利用室内获得的抗白粉病的黄瓜自交系SL02(DSI＝5.0)，易感病自交系XL01(DSI＝96.8)。以SL02为母本杂交、自交得到F2分离群体215个单株。F2群体的215个单株的发病情况为：0级40株，1级93株，3级65株和5级17株。
表3亲本及F2群体的发病情况鉴定
3、参照实施例2中的方法，检测供体抗性亲本SL02与受体感病材料XL01杂交的F2分离群体单株抗感白粉病的表型结果如表4。F2分离群体单株表型鉴定结果与基因分型结果高度对应，在F2群体中与抗病亲本SL02的纯合基因型G:G一致的有8株0级，12株1级，9株3级，1株5级，与感病亲本XL01纯合基因型A:A一致的有7株0级，31株1级，22株3级，12株5级，A:G碱基型为杂合型植株共114株。
4、对F2群体的基因型和表型相关性验证结果进行t-test分析，结果为p＝0.029(p<0.05)，显示CS_K_040108标记与黄瓜白粉病抗病性紧密相关。
表4 CS_K_040108标记在F2分离群体检测结果
本发明涉及黄瓜抗白粉病材料的SNP分子标记，该标记位于位于黄瓜第4号染色体，关联区域在NCBI编号NC_026660.1的片段上，起始位置22.3Mb，终止位置23.1Mb，根据替换序列末尾碱基设计SNP标记，该SNP分子标记多态性为A/G。本发明提供了用于检测该SNP位点的特异性引物组合和检测方法，所述特异性引物组合分别如表1所示。本发明的SNP分子标记可用于黄瓜抗白粉病的预测，可以用于筛选和鉴定自然遗传材料是否具有抗白粉病的性状。本发明提供的检测方法准确可靠，操作简便，适用于高通量商业化分子育种的应用，为黄瓜抗白粉病品种的选育或改良提供了科学依据。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的SNP分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 黄瓜(Cucumis sativus)
<400> 2
taactccaac tactctcttt tcagttcttt tcatttccca aacactacca rtctcatctg 60
tcaaacaaat tgggcatata atgagtattg acagtagagt a 101
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc ttttcatttc ccaaacacta ccag 44
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tttcatttcc caaacactac caa 43
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcccaattt gtttgacaga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21