本发明属于南瓜低聚糖的纯化技术领域，具体涉及一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法。
背景技术：
大量研究已经证实南瓜中的多糖、低聚糖等功能性糖成分具有血糖调节功能，且该功能性糖作为一种天然植物来源的成分，安全性也受到广泛的认可。低聚糖(oligosaccharide)又可称为寡糖，是由2-10个单糖通过糖苷键连接成直链或支链的低度聚合糖，分子量在200～3000d之间。由于单糖分子结合位置和结合类型不同，形成了种类丰富的低聚糖。低聚糖有良好的功能特性，可作为甜味来源，但不被人体胃酸、胃酶降解，不在小肠吸收，进入大肠后选择性促进有益菌的增殖并抑制病原菌和腹泻，还有保护肝脏、降低血清胆固醇、抗龋齿等功能。低聚糖因其独特的功能特性备受关注，未来在功能食品、饲料和添加剂等领域有很好的研究价值和应用潜力。
目前，多采用水提醇沉法制备南瓜多糖，分离过程中大分子多糖沉淀后上清液中仍含大量的碳水化合物，推测为分子量较低的低聚糖。一般采用膜过滤法有效分离上清液中的南瓜低聚糖粗品，然而产品呈深棕褐色，是由南瓜中的色素及加工过程中产生的有色杂质引起，对南瓜低聚糖纯化、结构研究及工业化应用造成障碍。
目前在食品工业中常见的脱色方法有，如有机溶剂脱色法、活性炭脱色法、活性炭吸附脱色法，双氧水脱色法。然而，这些方法应用于南瓜低聚糖脱色时存在脱色效率低、破坏低聚糖结构如双氧水氧化破坏糖链、运营成本高及回收困难等问题。因此，研究一种高效、环保的南瓜低聚糖脱色、除杂方法具有重要意义。
大孔树脂是近几年发展起来的一类有机高分子吸附剂，是用于天然提取物脱色的有效方法。与传统脱色方法相比，大孔树脂脱色法具有操作简单，分离效率高，易于回收，成本低和污染小等特点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，从而克服现有南瓜低聚糖中有色物质脱色效果差、杂质去除率低、破坏低聚糖结构的缺点。
为实现上述一个或多个目的，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，包括如下步骤：
(1)将南瓜低聚糖粗提物加水，配成南瓜低聚糖上柱溶液；将0.8～1.5倍柱体积(bv)所述南瓜低聚糖上柱溶液通过装有大孔树脂的层析柱，进行上柱吸附，然后收集流出液；
(2)静置，然后用去离子水淋洗大孔树脂，将柱中剩余的南瓜低聚糖洗脱液与步骤(1)中所得流出液合并，然后蒸发浓缩、冻干，得到无色南瓜低聚糖；
(3)使用1.5～2.2bv的乙醇溶液洗脱吸附大孔树脂上的有色杂质；采用乙醇浸泡，用水洗至无醇味，采用naoh溶液通过树脂柱并浸泡，水洗至中性；然后采用盐酸通过树脂柱并浸泡，水洗至中性，回收大孔树脂；最后，经旋蒸蒸发和冷冻干燥，回收有色杂质和乙醇。
上述精制方法中，通过大孔树脂可以去除南瓜低聚糖粗提物中的部分单糖和蛋白质。具体去除原理是：依靠大孔树脂的分子筛作用，使得分子量不同的低聚糖和单糖得以分离；再根据蛋白质和糖本身的结构和物理、化学性质不同，导致南瓜低聚糖粗提物中的蛋白质和低聚糖在大孔树脂上的吸附、洗脱性能不同，使得部分蛋白质得以去除；总之，通过大孔吸附树脂最终除去了南瓜低聚糖中的部分单糖和蛋白质。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述步骤(1)中所述南瓜低聚糖上柱溶液的质量百分比浓度为230～280mg/ml；
和/或，所述南瓜低聚糖上柱溶液以0.8～1.5bv/h的流速通过装有大孔树脂的层析柱。
其中，大孔树脂量一定的情况下，上样流速慢、上样量少的实验组及洗脱速度慢、洗脱液量大的实验组脱色效果更好，但是速度过慢及量过大会导致成本上升。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述步骤(1)中所述大孔树脂使用前进行预处理，具体操作为：首先采用去离子水浸泡大孔树脂，用乙醇洗至不浑浊；然后用乙醇浸泡，用去离子水洗至无醇味；再用质量百分比浓度为5％的naoh溶液通过树脂柱并浸泡树脂，水洗至中性，将质量百分比浓度为5％的盐酸通过树脂柱并浸泡树脂，最后水洗至中性，即得到处理好的大孔树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述预处理中，采用去离子水浸泡和乙醇浸泡的时间是20～30h。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述预处理中，采用naoh溶液浸泡树脂或采用盐酸浸泡树脂的时间是1～4h。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述步骤(2)中，所述静置的时间为45～60min；
和/或，所述去离子水以1.0～3.0bv/h的速度淋洗大孔树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述步骤(3)中所述乙醇溶液的体积百分比浓度是60～80％。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，所述大孔树脂选自离子交换树脂、非极性大孔树脂中的一种或两种，优选是非极性大孔树脂。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，所述非极性大孔树脂选自dm21型大孔吸附树脂、dm28型大孔吸附树脂中的一种或几种。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，所述层析柱的材料为强化玻璃，规格为6cm×80cm；
和/或，所述大孔树脂使用时装入层析柱的3/4处。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，所述层析柱中装入树脂高径比为1∶10。其中，大孔树脂量一定情况下，层析柱高径比大，有利于去除单糖杂质。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述步骤(1)中所述南瓜低聚糖粗提物的制备方法包括：
(1)将南瓜去籽、切块，加水打浆，热水浸提，离心取上清液，浓缩至原上清液体积的1/2～1/5，得浓缩液；
(2)加入乙醇进行沉淀，离心取上清液；
(3)将上清液稀释并过20μm滤袋，滤液先通过超滤段，超滤膜截留分子量为3000da，透过液通过纳滤段，纳滤膜截留分子量为300da，被截留液体为南瓜低聚糖粗提物。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述南瓜低聚糖粗提物的制备方法中，步骤(1)中热水的温度是80～90℃，所述热水浸提的时间是1～3h。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述南瓜低聚糖粗提物的制备方法中，步骤(2)中所述乙醇溶液的体积百分比浓度为70～90％，优选为80％。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，上述南瓜低聚糖粗提物的制备方法中，步骤(2)中所述乙醇溶液与步骤(1)所得浓缩液的体积比为2～5∶1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将大孔树脂吸附技术应用于南瓜低聚糖的生产工艺中，大孔树脂吸附溶液中的有色杂质，由于分子筛作用对南瓜低聚糖粗品中的单糖杂质也有一定的去除作用，达到南瓜低聚糖高效脱色的同时，可同时去除单糖和蛋白质杂质，并可回收利用有色杂质；所得南瓜低聚糖的纯度高，高达94～96％，经高效液相色谱检测发现无明显杂质，进一步提高了南瓜低聚糖产品的品质。
(2)本发明采用的精制方法中，在配制南瓜低聚糖上柱溶液时不需要调节ph值既可高效去除其杂质和颜色；本发明的精制方法处理条件温和、能耗低、产生的废弃物少，在大孔树脂脱色过程中，不要高温或酸碱处理，不用引起南瓜低聚糖的降解，而且通过精制前后南瓜低聚糖的红外光谱对比可以证明，主成分低聚糖的结构未发生改变。
(3)本发明的精制方法所去除的有色杂质为南瓜低聚糖提取过程中美拉德反应产生的有色物质类黑精，与传统的活性炭脱色和过氧化氢脱色法相比，可分别收集低聚糖脱色液(水洗)和有色杂质洗脱液(70％乙醇洗)，在保留低聚糖本身的结构特征及性质的同时可以回收有色成分(回收率79％)；另外，由于美拉德反应的颜色产物类黑精在一些研究中报道具有抗氧化、防龋齿及血糖调节作用，因此本发明回收的有色成分在保健食品原料及功能性添加剂方面有较好的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分。在附图中：
图1是根据本发明的南瓜低聚糖液精制前后颜色的对比。
图2是根据本发明实施例1所得的南瓜低聚糖液分子量检测的高效液相色谱图(hplc)。
图3是根据本发明实施例2所得的南瓜低聚糖液紫外-可见光全波长扫描图。
图4是根据本发明实施例1所得的南瓜低聚糖液红外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
紫外可见光全波长扫描采用的实验设备及条件：紫外-可见光分光光度计uv-visspectrophotometer(t6-1650e)。
分子量高效液相色谱采用的实验设备及条件：德国诺尔knauer高效液相色谱仪，进样量20ul，检测时间20min，进样浓度1％，柱温38℃。
红外光谱采用的实验设备及条件：傅里叶红外光谱仪nicolet6700ftirspectrometer(madison,wi,u.s.a)。
实施例1
一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，按照如下步骤进行：
(1)大孔树脂预处理：采用去离子水浸泡dm28型大孔吸附树脂24h，用乙醇洗至不浑浊，乙醇浸泡24h，用水洗至无醇味，用质量百分比浓度为5％的naoh溶液通过树脂柱并浸泡2h，水洗至中性，将质量百分比浓度为5％的hcl通过树脂柱并浸泡4h，水洗至中性，4℃备用；使用时装入层析柱(6cm×80cm)3/4处，确保填料均匀平整且无气泡；
(2)将南瓜低聚糖粗提物加水配成浓度为250mg/ml的溶液，将1.0倍柱体积(bv)的上述溶液以1.0bv/h的流速通过装有大孔树脂的层析柱，进行上柱吸附，然后收集流出液；
(3)待南瓜低聚糖溶液全部通过装有大孔树脂的分离柱后，静置50min，然后用2.0bv去离子水以1.5bv/h的速度淋洗吸附了有色杂质的大孔树脂，将柱中剩余的南瓜低聚糖洗脱与步骤(2)所得流出液合并后蒸发浓缩，冻干后得到无色的南瓜低聚糖；
(4)再使用2.0bv的体积百分比浓度为70％的乙醇溶液以1.5bv/h的速度将吸附在大孔树脂上的有色杂质洗脱；
(5)每次操作完成后进行大孔树脂清洗回收，采用乙醇浸泡24h，用水洗至无醇味，采用5％naoh溶液通过树脂柱并浸泡2h，水洗至中性，5％hcl通过树脂柱并浸泡2h，水洗至中性，回收大孔树脂；最后，采用旋蒸蒸发和冷冻干燥，回收有色杂质和乙醇。
上述南瓜低聚糖粗提物的制备方法包括：将南瓜去籽、切块，加2～5倍重量的水打浆，采用温度为85℃的热水浸提2h，离心取上清液，浓缩至原上清液体积的1/2；
然后，加入2倍体积80％乙醇沉淀，离心取上清液；将提取南瓜多糖后的上清液稀释并过20μm滤袋；
滤液先通过超滤段，超滤膜截留分子量为3000da，而后通过纳滤段，纳滤膜截留分子量为300da，被截留液体为南瓜低聚糖粗提物。
实施中所用大孔树脂型号为dm28型大孔吸附树脂；层析柱材料为强化玻璃，规格为(6cm×80cm)，装入树脂径高比为1∶10；通过装有大孔树脂的层析柱后，静止时间为55min。
本实施例制备的南瓜低聚糖液精制前后颜色对比如图1所示，经过大孔树脂精制处理后，南瓜低聚糖的脱色率达到92.6％，从图1中颜色对比可以看出，经过大孔吸附树脂处理后，深棕色溶液变成了接近透明的溶液，因此，本实施的精制方法取得了较好的脱色效果。
根据图2中实施例1所得南瓜低聚糖液分子量检测的高效液相色谱图所示，经过精制后南瓜低聚糖液的分子量分布集中在1000～1300da，分子量范围属于低聚糖分子量分布的范围，纯度为96％，脱色率为92.4％。
根据图4中实施例1所得南瓜低聚糖液的红外光谱图表明，脱色前后南瓜低聚糖的主要组分的化学结构无显著差异，说明在精制过程中大孔吸附树脂法不会对南瓜低聚糖的结构造成破坏，可以很好地保护南瓜低聚糖中的官能团。
实施例2
一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，按照如下步骤进行：
(1)大孔树脂预处理：采用去离子水浸泡dm21型大孔吸附树脂30h，用乙醇洗至不浑浊，乙醇浸泡30h，用水洗至无醇味，用质量百分比浓度为5％的naoh溶液通过树脂柱并浸泡4h，水洗至中性，将质量百分比浓度为5％的hcl通过树脂柱并浸泡4h，水洗至中性，4℃备用；使用时装入层析柱的3/4处，确保填料均匀平整且无气泡；
(2)将南瓜低聚糖粗提物加水配成浓度为280mg/ml的溶液，将1.5倍柱体积(bv)的上述溶液以1.5bv/h的流速通过装有大孔树脂的层析柱，进行上柱吸附，然后收集流出液；
(3)待南瓜低聚糖溶液全部通过装有大孔树脂的分离柱后，静置60min，然后用2.5bv去离子水以1.0bv/h的速度淋洗吸附了有色杂质的大孔树脂，将柱中剩余的南瓜低聚糖洗脱与步骤(2)所得流出液合并后蒸发浓缩，冻干后得到无色的南瓜低聚糖；
(4)再使用2.2bv的体积百分比浓度为80％的乙醇溶液以1.0bv/h的速度将吸附在大孔树脂上的有色杂质洗脱；
(5)每次操作完成后进行大孔树脂清洗回收，采用乙醇浸泡24h，用水洗至无醇味，采用5％naoh溶液通过树脂柱并浸泡4h，水洗至中性，5％hcl通过树脂柱并浸泡4h，水洗至中性；最后，回收大孔树脂；最后，采用旋蒸蒸发和冷冻干燥，回收有色杂质和乙醇。
上述南瓜低聚糖粗提物的制备方法包括：将南瓜去籽、切块，加5倍重量的水打浆，然后行采用温度为90℃的热水浸提2h，，离心取上清液，浓缩至原上清液体积的1/5；
然后，加入5倍体积80％乙醇沉淀，离心取上清液；将提取南瓜多糖后的上清液稀释并过20μm滤袋；
滤液先通过超滤段，超滤膜截留分子量为3000da，而后通过纳滤段，纳滤膜截留分子量为300da，被截留液体为南瓜低聚糖粗提物。
本实施中所用大孔树脂型号为dm21型大孔吸附树脂；层析柱材料为强化玻璃，规格为6cm×80cm，装入树脂径高比为1∶10；通过装有大孔树脂的层析柱后，静止时间为50min。
本实施例制备的南瓜低聚糖脱色率为89.1％，纯度为95％，并根据图3所示的南瓜低聚糖液脱色前后紫外-可见光谱对比可知，280nm处蛋白吸收峰出现下降，因此，本实施例2可脱除将南瓜低聚糖粗提物中的蛋白。
实施例3
本实施例采用的南瓜低聚糖粗提物为实施例1中制得的南瓜低聚糖粗提物。
一种采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法，按照如下步骤进行：
(1)大孔树脂预处理：采用去离子水浸泡dm28型大孔吸附树脂20h，用乙醇洗至不浑浊，乙醇浸泡20h，用水洗至无醇味，用质量百分比浓度为5％的naoh溶液通过树脂柱并浸泡1h，水洗至中性，将质量百分比浓度为5％的hcl通过树脂柱并浸泡1h，水洗至中性，4℃备用；使用时装入层析柱(6cm×80cm)3/4处，确保填料均匀平整且无气泡；
(2)将南瓜低聚糖粗提物加水配成浓度为230mg/ml的溶液，将0.8倍柱体积(bv)的上述溶液以0.8bv/h的流速通过装有大孔树脂的层析柱，进行上柱吸附，然后收集流出液；
(3)待南瓜低聚糖溶液全部通过装有大孔树脂的分离柱后，静置45min，然后用1.5bv去离子水以1.0bv/h的速度淋洗吸附了有色杂质的大孔树脂，将柱中剩余的南瓜低聚糖洗脱与步骤(2)所得流出液合并后蒸发浓缩，冻干后得到无色的南瓜低聚糖；
(4)再使用2.2bv的体积百分比浓度为60％的乙醇溶液以1.5bv/h的速度将吸附在大孔树脂上的有色杂质洗脱；
(5)每次操作完成后进行大孔树脂清洗回收，采用乙醇浸泡24h，用水洗至无醇味，采用5％naoh溶液通过树脂柱并浸泡2h，水洗至中性，5％hcl通过树脂柱并浸泡2h，水洗至中性，回收大孔树脂；最后，采用旋蒸蒸发和冷冻干燥，回收有色杂质和乙醇。
本实施例制备的南瓜低聚糖脱色率为88.6％，纯度为94％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。