本发明涉及一种从镰形棘豆中制备oxytroflavoside六种化合物的方法及其用途。
背景技术：
：镰形棘豆(oxytropisfalcatebunge)是豆科棘豆属的一种药用植物，多年生草本，广泛分布于我国西藏、青海、甘肃南部、四川西部及新疆海拔2700-4300m的海滩、沙地、山坡、沟谷、草甸，资源丰富，藏药称“莪大夏”、“达夏”，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉止血、通利大便等功效，是我国青藏高原常用的民间草药之一。镰形棘豆中主要含有生物碱、黄酮类等化合物，其中黄酮类成分具有抗菌、抗氧化自由基、抗肿瘤、止咳等活性。目前已分离得到的黄酮类化合物多达二十余种，主要以黄酮苷、黄酮及二氢黄酮、黄酮醇、查耳酮、氢查耳酮、异黄烷及黄烷酮等形式存在。wang等人(wangss,zhangxj,ques,etal.3-hydroxy-3-methylglutarylflavonolglycosidesfromoxytropisfalcata.[j].journalofnaturalproducts,2012,75(7):1359-1364)首次从镰形棘豆中提取出7种黄酮醇衍生物：oxytroflavosidea、b、c、d、e、f、g，然而提取方法却复杂繁琐，而且分离方法采用常规的硅胶柱层析方法，周期长，重复性差，而且对环境有很大的影响。因此，现在仅需一种高效、简便的同时制备oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新的镰形棘豆oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的制备方法，包括以下步骤：(1)提取：取镰形棘豆粉碎，用乙醇提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液；(2)除杂：取上述粗提取液，用陶瓷膜过滤后用大孔树脂柱分离，依次用40％乙醇溶液，60％乙醇溶液进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收乙醇后得粗提物；(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用c18色谱柱进行梯度洗脱后即得fr.1、fr.2、fr.3、fr.4四个组分；洗脱条件为：流动相a为0.2％v/v乙腈溶液，流动相b为0.2％v/v的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％a；(4)二维分离制备：分别将步骤(3)所得4个组分用c18色谱柱洗脱，即得oxytroflavosidea、b、c、d、f、g；洗脱条件为：流动相a为0.2％v/v乙腈溶液，流动相b为0.2％v/v的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％a。进一步地，步骤(1)中，乙醇的体积浓度为5～95％。进一步地，步骤(1)中，镰形棘豆与乙醇的重量体积比为1:5～30kg/l。进一步地，步骤(2)中，所述陶瓷膜的孔径为0.1μm～0.5μm。进一步地，步骤(2)中，所述大孔树脂柱的型号为ab-8或d101。进一步地，步骤(3)中，所述梯度洗脱的流速为10ml/min。进一步地，步骤(3)中，所梯度洗脱的检测波长为280nm。本发明还提供了上述方法制备的oxytroflavosidea、b、c、d、f、g在制备抗炎药物中的用途。本发明还提供了一种抗炎的药物组合物，它是以oxytroflavosidea、b、c、d、f、g中的任意一种或多种为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。进一步地，所述活性成分的浓度为30μm；所述制剂为口服制剂、注射剂、外用制剂。实验结果表明，采用本发明的方法，可以同时制备得到了镰形棘豆oxytroflavosidea、b、c、d、f、g六种化合物，该制备方法的操作简便、得到的产物纯度高，具有广阔的市场应用前景。并且本发明的发明人意外的发现6种镰形棘豆oxytroflavoside化合物在30μm的浓度下抗炎效果明显，为镰形棘豆的抗炎物质基础提供理论依据。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为本发明实施例1步骤(3)中4种组分的色谱图。图2为本发明实施例1步骤(4)中fr.2与fr.3二维制备色谱图，其中，a图为fr.2的二维制备色谱图，色谱峰从左到右依次为oxytroflavosidef、a、b、c；b图为fr.3的二维制备色谱图，色谱峰从左到右依次为oxytroflavosidea、b、c。图3为本发明实施例1步骤(4)中6种化合物的色谱图，其中1为oxytroflavosideg，2为oxytroflavosidef，3为oxytroflavosidea，4为oxytroflavosideb，5为oxytroflavosidec，6为oxytroflavosided。具体实施方式实施例1、oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的制备(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用60l5％v/v的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液。(2)除杂：a取上述粗提取液，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3mpa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用ab-8大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用c18色谱柱洗脱后即得fr.1、fr.2、fr.3、fr.4四个组分，所得色谱图见图1。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％a；流速为10ml/min，检测波长为280nm。(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用xchargec18色谱柱洗脱，即得oxytroflavosidea、b、c、d、f、g。其中，fr.2与fr.3二维制备色谱图见图2，6种化合物的纯度色谱图见图3。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％a。通过4个组分的二维制备色谱图可知fr.1为oxytroflavosideg，fr.2为oxytroflavosidef、a、b、c混合物，fr.3为oxytroflavosidea、b、c混合物，fr.4为oxytroflavosided。所得oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的结构分别如下：实施例2、oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的制备(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用10l95％v/v的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得浸膏。(2)除杂：a取上述浸膏，加水溶解后，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3mpa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用d101大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用c18色谱柱洗脱后即得fr.1、fr.2、fr.3、fr.4四个组分。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％a；流速为10ml/min，检测波长为280nm。(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用xchargec18色谱柱洗脱，即得oxytroflavosidea、b、c、d、f、g。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％a。实施例3、oxytroflavosidea、b、c、d、f、g的制备(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用40l50％v/v的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得浸膏。(2)除杂：a取上述浸膏，加水溶解后，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3mpa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用d101大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用c18色谱柱洗脱后即得fr.1、fr.2、fr.3、fr.4四个组分。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％a；流速为10ml/min，检测波长为280nm。(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用xchargec18色谱柱洗脱，即得oxytroflavosidea、b、c、d、f、g。洗脱条件为：流动相a为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相b为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％a。以下通过试验例来说明本发明的有益效果。试验例1、本发明6种oxytroflavoside的抗炎作用1实验材料小鼠巨噬细胞raw264.7巨噬细胞株、lps、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)检测试剂盒、前列腺素e2(peg2)检测试剂盒(sigma公司)本发明制备的oxytroflavosidea、b、c、d、f、g。2实验方法小鼠raw246.7巨噬细胞加入含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和链霉素的rmpi1640培养基，置于含5％co2、37℃培养箱中培养。细胞生长至70％～80％融合后进行传代，1～2d换液1次，4～6d传代1次。实验分为8组，分别为正常组，lps模型组和oxytroflavosidea组(30μm)、oxytroflavosideb组(30μm)、oxytroflavosidec组(30μm)、oxytroflavosided组(30μm)、oxytroflavosidef组(30μm)、oxytroflavosideg组(30μm)。将密度为1×106个/ml的raw264.7细胞悬液加入6孔板内，每孔1ml，每组设6个平行孔，置于37℃、5％co2孵箱培养。各实验组处理方法如下:①正常组，在培养基中培养；②lps模型组，在培养基中加入浓度为1μg/mllps培养；③oxytroflavosidea组、b组、c组、d组、f组、g组(30μm)，在培养基中分别加入浓度为1μg/mllps和30μm的oxytroflavosidea(或oxytroflavosideb、c、d、f、g)共培养。培养24h后，收集上清液，采用elisa法进行peg2、tnf-α含量检测，具体方法按试剂盒说明进性。2、实验结果表1lps诱导细胞peg2含量变化浓度(um)peg2(pg/ml)空白1633.38lps3345.28oxytroflavosidea302339.25oxytroflavosideb302456.12oxytroflavosidec302567.65oxytroflavosided302395.30oxytroflavosidef302422.81oxytroflavosideg302472.49表2tnf-α含量变化从表1和表2可以看出，本发明制备的镰形棘豆oxytroflavosidea、b、c、d、f、g化合物主要通过抑制炎症因子tnf-α、peg2等释放，直接发挥抑制作用，从而表现出抗炎作用。综上，采用本发明的方法，可以同时制备得到了镰形棘豆oxytroflavosidea、b、c、d、f、g六种化合物，该制备方法的操作简便、得到的产物纯度高，具有广阔的市场应用前景。并且本发明的发明人意外的发现6种镰形棘豆oxytroflavoside化合物在30μm的浓度下抗炎效果明显，为镰形棘豆的抗炎物质基础提供理论依据。当前第1页12