本发明涉及生物医药
技术领域：
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背景技术：
：鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)是我国南方最常见的恶性肿瘤之一，在华南地区，尤其广东省发病率最高，居世界首位，故又著称“广东癌”。npc对放射敏感，首选放疗，其预后因疾病分期不同而差异巨大。i、ⅱ期患者单纯放疗效果明显，十年疾病相关生存率、无复发生存率、无远地转移生存率都较高。但npc起病隐匿，早期症状缺乏特异性，约75％的患者确诊时已属iii、iv期。晚期npc的疗效仍相当令人失望，易出现复发和远处转移，5年生存率仅35％。因此，早发现、早治疗是提高鼻咽癌患者生存率的关键。鼻咽癌的发生发展是一个多因素、多基因参与的动态过程，因此，探索其动态发展的分子机制，寻找鼻咽癌相关分子标志物，以进一步明确其发病机制，并开发出可应用于临床早期诊断、治疗和预后评估的试剂或产品，对提高鼻咽癌的诊疗水平、减低复发转移率具有重要意义。rna干扰(rnainterference，rnai)是生物进化中一项保守的防御机制，于1998年首先发现。其本质是由双链rna介导的与之同源的mrna特异性降解，进而抑制相应基因表达的过程。由于其基因抑制效果确切，具有级联式放大效应和高穿透性等特点，因而在恶性肿瘤的研究中具有很好的应用前景。因此，通过适当的技术生产特异性的sirna并使其能有效地作用于靶基因的mrna，即能实现基因沉默的目的。将外源性dna导入真核细胞并进行转录和表达的方式主要包括非病毒载体系统的细胞转染和以病毒为载体的细胞感染方式。慢病毒载体是在人免疫缺陷病毒(hiv-i)基础上改造成的病毒载体系统，能高效的将目的基因(或rnai)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒介导的基因表达或rnai作用持续且稳定，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，随细胞基因组的分裂而分裂，并能有效感染并整合到非分裂细胞中。鉴于慢病毒载体介导的外源基因可以在动物体内实现长期稳定的表达，同时不引起明显的免疫反应，慢病毒载体已经成为研究基因功能的强有力的工具。技术实现要素：为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供了一种stil基因在制备鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/预后评估的试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种stil基因小分子干扰rna靶标片段，其序列如seqid№1所示。本发明所采取的技术方案是：一种stil基因小分子干扰rna，能够特异性沉默stil基因的表达，所述stil基因小分子干扰rna以seqid№1作为特异性沉默stil基因表达的靶点序列，所述stil基因小分子干扰rna为shrna，包含正链rna片段和反链rna片段，所述正链rna片段和所述反链rna片段互补，所述正链rna片段含有seqid№1编码的rna。进一步，所述stil基因小分子干扰rna的序列为seqid№2编码的rna。本发明的另一个目的在于提供一种stil基因的rna干扰核酸构建体，包括如前所述的stil基因小分子干扰rna的序列片段。进一步，所述stil基因的rna干扰核酸构建体为stil基因干扰慢病毒载体。一种stil基因干扰慢病毒，由上述的stil基因的rna干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。一种药物组合物，含有治疗有效量的stil基因小分子干扰rna或stil基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明还公开了rna干扰慢病毒载体的构建方法，包括步骤：1)dnaoligo序列合成：根据如seqid№1所示的靶点序列设计干扰序列，在干扰序列的两端添加agei和ecori酶切位点，且端添加终止信号，分别合成如seqid№2和seqid№3所示的单链dnaoligo；2)将合成的单链dnaoligo干粉溶解于终浓度100m的退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温，形成带粘性末端的双链；3)将双链dnaoligo与线性化的tm4噬菌体相连，连接产物命名为psc24186；4)将psc24186转化大肠杆菌感受态细胞。本发明的有益效果是：，本发明设计了针对stil基因的20个rnai靶点序列，构建相应的stilrnai载体，其中编码序列seqid№1的rnai载体psc24186能够显著下调stil基因在mrna水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为lv)作为基因操作工具降低stil基因的表达水平，显著抑制鼻咽癌肿瘤细胞的增殖能力。本发明提供的sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制stil基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中stil基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。附图说明图1表示gv115质粒dna图谱；图2表示rna干扰载体阳性克隆鉴定电泳图；图3表示stil基因干扰后，鼻咽癌细胞株cne2增殖受到抑制的情况，a)为绝对数结果图，b)为变化倍数结果图；图4为stil敲除前后其mrna表达水平对比图；图5为蛋白质印迹法对比结果图；图6为celigo检测stil基因消减对细胞增殖的结果，a)为绝对数结果图，b)为变化倍数结果图；图7为mtt比色法检测stil基因消减对细胞增殖的结果，a)为绝对数结果图，b)为变化倍数结果图；图8为流式细胞荧光分选技术检测stil基因消减对a)细胞凋亡和b)细胞周期的影响结果图；图9位动物成瘤结果图，其中a)为瘤体积变化对比图，b)为肿瘤重量变化对比图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括pcr扩增、质粒提取、质粒转化、dna片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：rna干扰靶点设计及双链dnaoligo制备。1)rna干扰靶点设计：根据rna干扰序列设计原则，以stil基因为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取序列gattaaactgcatgtcatt(seqid№1)作为干扰靶点；2)dnaoligo序列合成根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列，设计完成后送捷瑞公司合成单链dnaoligo；*ccgg：agei酶切位点；aattc：ecori酶切位点；g：ecori酶切位点互补序列。3)双链dnaoligo制备：将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度100m)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。实施例2：rna干扰慢病毒载体构建。1.连接：按照fermentast4dnaligase说明书配制20μl反应体系，将双链dnaoligo与线性化的载体(如图1所示的gv115)相连。于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc24186，之后进行转化。2.转化：将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，操作步骤如下：1)将10μl连接产物psc24186加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；2)42℃热激90sec，冰浴2min；3)加入500μl无抗生素的lb液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr；4)取150μl菌液均匀涂抹在含有amp的lb固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。3.阳性克隆的pcr鉴定：3.1引物：3.2pcr扩增：按下表配制20μlpcr反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行pcr扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。pcr结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，电泳结果如图2所示。4.阳性克隆测序结果分析：以鉴定引物-f进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。psc24186测序结果：tagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggtggattaaactgcatgtcattctcgagaatgacatgcagtttaatccatttttaattctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatg(seqid№7)。＊shrna干扰序列插入片段用下划线字体标注，其中agei酶切位点被破坏。实施例3：干扰后hcs细胞增殖筛选。使用高内涵筛选的方法，通过比较基因敲减对细胞增殖速度的影响在待检目的基因中初步筛选出增殖抑制表型明显的基因。细胞名培养基hcs96孔种板数cne-2z1640+10％fbs2000cell/well为保证基因干扰效率，本次实验针对每个基因设计3个rna干扰靶点，并将携带不同靶点的3个质粒等比例混合进行慢病毒包装，从而确保病毒感染细胞后在后续hcs实验中目的基因的敲减效率。病毒列表如下：基因病毒编号ctrl阴性对照(non-targetingshrna)pc原癌基因xspecific-targetingshrnastilpsc24185mixhes6psc37542mixhist1h3dpsc14202mixrad51ap1psc34535mixybx3psc19827mixcenpnpsc32095mixarhgap11apsc30053mixzwintpsc13975mixdlgap5psc24130mixube2tpsc14025mixncapgpsc29896mixcdca3psc14193mixyeats4psc27070mixmnd1psc24156mixmtfr2psc24144mixtrip13psc24144mixpbkpsc23271mixdscc1psc29887mixkifc1psc2253mixpc为阳性靶标病毒，对目的基因有70％以上的敲减效率。目的基因产物在哺乳动物细胞转录过程中起重要作用。沉默该目的基因，能够在多株肿瘤细胞中引起显著的细胞增殖抑制，因此作为细胞增殖相关实验的阳性参照，以证明检测体系的稳定性。细胞生长曲线根据细胞被感染后所表达的荧光蛋白信号，可对细胞拍照并进行计数，并根据细胞数量绘制曲线观察其增殖情况。增殖倍数变化(ctrl/实验组)：以增殖检测第5天、ctrl组(阴性对照组)细胞计数倍数值比实验组细胞计数倍数值的foldchange值为判断依据。当foldchange≥2.0时，即该实验组细胞相比ctrl组细胞，细胞增殖显著减缓，从而推断该实验组目的rnai慢病毒针对的目的基因为增殖相关的阳性基因。hcs筛选结果总结shctrl、shpc及增殖抑制阳性组细胞代表结果总结说明：1).此hcs筛选结果显示：ctrl组细胞增殖正常，第五天相比第一天的增殖倍数达到5.29倍；pc组(增殖抑制阳性对照细胞组)细胞增殖显著减缓，第五天相比第一天的增殖倍数仅0.82倍，ctrl与之相比的foldchange＝6.46。2).在待测的19个实验组中，增殖倍数变化≥2的实验组(增殖抑制阳性细胞组)，即增殖抑制阳性的实验组为：stil(如图3所示)。实施例4：癌与癌旁组织基因表达验证。选择13对癌与癌旁标本，使用已经被报道的5个基因(casp3,egfr,cdk4,jun,pcna)作为marker基因进行qpcr检测，当在一个样本中有3个以上的marker基因在癌与癌旁中的表达情况与报道相符，则认为此样本为强参考，当有2个的时候，则为弱参考，当＜2个，则不做参考，最终，13对样本中6对为弱参考，7对作为强参考。由此，目的基因stil在4对强参考和3对弱参考中表现为上调。实施例5：干扰后增殖凋亡细胞周期。慢病毒干扰：经shrna慢病毒感染3天后，实验组cne-2z细胞中stil基因在mrna水平的表达量受到抑制，如图4所示。从westernblot结果可以看出，靶点对stil基因的外源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用，如图5所示。celigo检测stil基因消减对细胞增殖的影响：经shrna慢病毒感染3天后，实验组cne-2z细胞的增殖速率受到显著抑制，如图6所示。提示stil基因与cne-2z细胞的增殖能力显著相关。mtt检测stil基因消减对细胞增殖的影响，经shrna慢病毒感染3天后，实验组cne-2z细胞的增殖速率受到显著抑制，如图7所示。提示stil基因与cne-2z细胞的增殖能力显著相关。facs检测stil基因消减对凋亡的影响，shrna慢病毒感染3天后，实验组发生凋亡的cne-2z细胞显著增加，提示stil基因与cne-2z细胞的凋亡显著相关，如图8的a)所示。facs检测stil基因消减对细胞周期的影响，shrna慢病毒感染5天后，实验组处于s期的细胞显著增多，实验组处于g1期和g2/m期的细胞显著减少，提示stil基因与cne-2z细胞的周期分布显著相关，如图8的b)所示。实施例6：动物成瘤试验。干扰了stil后动物体内肿瘤显著减小，结果如图9所示。sequencelisting<110>佛山市第一人民医院<120>stil基因的用途及其相关药物<130>2018<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>未知<400>1gattaaactgcatgtcatt19<210>2<211>48<212>dna<213>人工序列<400>2tggattaaactgcatgtcattctcgagaatgacatgcagtttaatcca48<210>3<211>58<212>dna<213>人工序列<400>3ccggtggattaaactgcatgtcattctcgagaatgacatgcagtttaatccatttttg58<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列<400>4aattcaaaaatggattaaactgcatgtcattctcgagaatgacatgcagtttaatcca58<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5cctatttcccatgattccttcata24<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gtaatacggttatccacgcg20<210>7<211>653<212>dna<213>人工序列<400>7tagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtg60acgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatgga120ctatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtg180gaaaggacgaaacaccggtggattaaactgcatgtcattctcgagaatgacatgcagttt240aatccatttttaattctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacgaattcggatc300cattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatca360attacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggta420aatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtat480gttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacgg540taaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgac600gtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatg653当前第1页12