本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒。
背景技术
乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤，乳腺癌生存率和发现早晚有很大关系，传统的诊断方法有：乳腺癌钼靶x线摄片、b超扫描、细针肿物穿刺细胞学检查等。这些方法检测时间较长，并且对被检测者的身体损伤较大，达不到早期筛查的目的。
本发明通过研究发现在血清基因水平上联合检测maspin和mir-17的表达水平，能够准确判断检测者是否患乳腺癌。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有乳腺癌传统方法所存在的问题，提供一种联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过研究发现maspin与乳腺癌呈负相关，mir-17与乳腺癌呈正相关，联合检测这两个基因对乳腺癌进行诊断有很高的准确率，因此，基因maspin和mir-17具有制备诊断乳腺癌试剂盒的用途。
一种联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒，包含检测基因maspin与mir-17表达的引物，以及检测内参基因表达的引物。maspin为目标基因时，gapdh为内参；mir-17为目标基因时，u6为内参。
进一步优选的，检测上述各基因的引物序列如下：
maspin上游引物：tgtaaataaagggatgg，
maspin下游引物：gatgtggaggatgagtc；
mir-17上游引物：tgtcaaagtgcttacagtg，
mir-17下游引物：cacagctcgtagaacaggagg；
gapdh上游引物：cggagtcaacggatttggtcgtat，
gapdh下游引物：agccttctccatggtggtgaagac；
u6上游引物：ctcgcttcggcagcaca，
u6下游引物：aacgcttcacgaatttgcgt。
进一步优选的，所述的联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒，还包含实时定量pcr反应试剂。
使用本发明试剂盒，通过提取检测者血液样本中的rna，进行反转录反应得到cdna，再以cdna为模板进行实时定量pcr反应，根据maspin和mir-17的表达水平可以判断检测者是否患有乳腺癌。
本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果：本发明发现了maspin与乳腺癌呈负相关，mir-17与乳腺癌呈正相关。使用本发明试剂盒进行检测，当maspin的ct值大于31，mir-17的ct值低于12时，可初步诊断为乳腺癌。本发明从基因水平上诊断乳腺癌比传统的提取被检测者的组织更精确而且减轻了患者的痛苦。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒，包含下述引物：
maspin上游引物：tgtaaataaagggatgg，
maspin下游引物：gatgtggaggatgagtc；
mir-17上游引物：tgtcaaagtgcttacagtg，
mir-17下游引物：cacagctcgtagaacaggagg；
gapdh上游引物：cggagtcaacggatttggtcgtat，
gapdh下游引物：agccttctccatggtggtgaagac；
u6上游引物：ctcgcttcggcagcaca，
u6下游引物：aacgcttcacgaatttgcgt。
实施例2
使用实施例1中所述的试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取检测者血液样本中的rna。
(2)使用takara公司的反转录试剂盒，进行反转录反应得到cdna。
(3)以cdna为模板进行实时定量pcr反应，反应体系及反应条件如下。
反应体系：sybrpremixextaq(2×)12.5μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，模板(cdna溶液)0.5μl，ddh2o10μl。
反应条件：用95℃作用3分钟；pcr进行35个循环，变性95℃30秒，退火58℃30秒，延伸72℃30秒。
按照上述方法检测了10组非乳腺癌患者和乳腺癌患者，实时定量pcr具体结果为：10例乳腺癌患者血液中的maspin的ct值(cyclethreshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)大于31；10例乳腺癌患者血液中的mir-17的ct值低于12。通过检测发现非乳腺癌患者maspin的表达量比乳腺癌患者的表达量高；非乳腺癌患者mir-17的表达量比乳腺癌患者血液中的表达量低，表明maspin与乳腺癌呈负相关，mir-17与乳腺癌呈正相关。
再随机选择100例乳腺癌患者，按照上述方法检测这些乳腺癌患者血液中maspin和mir-17的表达水平，其中95例乳腺癌患者maspin的ct值大于31，100例乳腺癌患者mir-17ct值低于12，该结果表明本发明检测准确率高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>武汉科技大学
<120>一种联合检测基因maspin和mir-17诊断乳腺癌的试剂盒
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
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<213>人工序列(artificialsequence)
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