一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法与流程

本发明涉及微生物质谱鉴定技术领域，尤其涉及一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。

背景技术：

微生物鉴定是食品、药品检验工作中的重要环节。快速、准确地鉴定食品、药品中的微生物种属可以有效溯源污染源、控制传播风险。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，maldi-tofms)技术可以对细菌的完整蛋白进行检测，根据图谱中特征性质谱峰，对细菌种、属进行准确鉴定，具有一定的溯源能力。该技术具有鉴定速度快、检测低成本、操作简便、结果准确等优势，因而在细菌鉴定中得到很好的发展。

近缘微生物的核酸序列相近，蛋白表达也基本一致，因此近缘微生物的maldi-tofms质谱图极为相似，仅在某些低丰度质谱峰或是质谱峰强度上存在细微差别，从而使近缘微生物的参考质谱图不可避免地出现最佳相似度的匹配。现有微生物maldi-tofms鉴定技术基于样品质谱图和参考质谱图的匹配以及相似度排序，虽然具备一定的细菌分型能力，但尚无法解决近缘微生物鉴定结果混淆的弊端。

具体来说，以志贺菌和大肠埃希菌为例，所述2种细菌属于近缘微生物范畴，核酸序列相似，其中16srrna基因全长仅1-2个碱基的差别，从遗传角度来看，志贺菌可被定义为是大肠埃希菌不产气的生物型。然而，大肠埃希菌多数属于正常肠道菌群，而志贺菌为致病菌，从医学角度来说有必要将志贺菌和大肠埃希菌做出正确区别。常规鉴别手段是采用生化反应，利用微生物在不同的培养条件下发生不同的生化反应，再根据培养基颜色变化、产气等反应现象判断微生物种属，检测时长一般在8小时-3天不等(甚至需要耗时3-5天)，该方法鉴定周期长，操作步骤复杂，结果受操作者主观判断影响，很难满足目前快速、准确鉴定细菌的需求。maldi-tofms技术虽然检测速度快，但是由于志贺菌和大肠埃希菌的蛋白质谱图基本一致，maldi-tofms技术只能鉴别到志贺菌属或大肠埃希菌属，无法正确鉴定二者，志贺菌常被错误地鉴定为大肠埃希菌，这一点是maldi-tofms技术在细菌鉴定应用中公知的不足之处；再者目前，虽然maldi-tofms技术是最快速的微生物鉴定方法，但是由于近缘微生物的鉴定策略牵涉到生化鉴定作为补充试验，这无疑抵消了maldi-tofms技术检测速度快的优势。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。

本发明以麦康凯培养基为基础进行研究，发现麦康凯培养基诸多成分中乳糖是关键因素，因此发明人设计了在普通细菌培养基中加入乳糖以缩短培养时间的方法，并将该方法进行验证。通过上述方法，本发明将生化鉴定原理与maldi-tofms技术相结合，将志贺菌和大肠埃希菌培养于含有乳糖或者不含乳糖的培养条件下，诱导大肠埃希菌在不同生长条件下产生差异蛋白，再通过maldi-tofms技术检测差异蛋白，根据差异蛋白检测结果判断是否为大肠埃希菌或志贺菌，实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法，其包括以下步骤：包括如下步骤：

步骤1)将试验细菌以菌液的方式在上述添加乳糖的培养基中培养一预定时间，获得细菌试验样品；

步骤2)对步骤1)中获得的细菌试验样品进行细菌蛋白前处理；

步骤3)采用质谱仪对步骤2)中处理后的细菌试验样品进行检测，并采集数据；

步骤4)对步骤3)采集的数据进行处理与比对分析，以鉴定所述近缘微生物。

为了进一步优化上述质谱鉴定方法，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述近缘微生物为志贺菌和大肠埃希菌。

进一步地，所述培养基为适于添加乳糖的细菌培养基，包括tsa培养基或液体tsb培养基。

进一步地，所述培养基中乳糖的浓度为1％～6％，所述细菌在培养基中的培养时间为2h～24h；更进一步地，所述培养基中乳糖的浓度为6％，细菌在培养基中的培养时间为2h，其中，乳糖的浓度为质量体积比。

进一步地，步骤1)中细菌培养的具体步骤如下：试验前，取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中，恒温静置培养一定时间，制得菌液。将菌液加入添加乳糖的培养基中，恒温静置培养一定时间，挑取单个菌落，悬浮于装有纯水的离心管中，获得细菌试验样品。更具体地说，试验用细菌工作代菌株储存于-80℃低温冰箱；试验前，取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中，于35℃恒温静置培养24h，制得菌液；将菌液均匀加至不同条件(乳糖的浓度不同)培养基表面，35℃恒温静置培养一定时间，在生物安全柜中挑取单个菌落，悬浮于装有300μl纯水的1.5ml离心管中，获得细菌试验样品。

进一步地，所述步骤2)细菌蛋白前处理的具体如下：将细菌试验样品进行离心，弃上清，加入甲酸水溶液，涡旋混合，再加入乙腈，离心，去上清液，点于样品板上；待样品点干燥后再滴加基质，放置干燥后进样。具体来说，将装有细菌试验样品的1.5ml离心管置于离心机中，12000g/min离心3min，弃上清，加入50μl70％甲酸水溶液，涡旋混合3min，再加入50μl乙腈，12000g/min离心3min，去上清液1μl点于样品板上；待样品点干燥后再滴加1μl基质，放置干燥后进样。

进一步地，所述步骤3)中质谱仪的检测条件如下：样品板载入质谱仪后激活激光系统，稳定30min，采用标准蛋白校正仪器，设置激光强度为3200。

进一步地，所述步骤4)中数据的处理及分析步骤如下：采用采样软件对采集的数据进行处理，在分析软件中同时打开试验细菌的待比对图谱，校正图谱基线，去除图谱噪音，对比图谱。具体来说，采用采样软件对质谱仪采集的数据进行对比分析，在分析软件中同时打开待比对图谱，选择advancedbaselinecorrection，设置参数为2.0，校正图谱基线；选择noisefilter去除图谱噪音，对比图谱，缺少或增加特征质谱峰的为大肠埃希菌，否则为志贺菌。

进一步地，所述质谱仪为maldi-tofms高分辨质谱仪，采样软件为4000seriesexplorer4.0数据处理系统，分析软件为dataexplorerv4.5。上述设备也可采用其他合适的同类型设备。

进一步地，比对分析中所得出的所述特征质谱峰(差异蛋白的质荷比)为m/z2370.72±10、m/z2401.04±10、m/z3824.84±10、m/z5757.15±10。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明是利用微生物在不同培养条件下蛋白表达存在差异，采用maldi-tofms检测差异蛋白来实现近缘微生物的鉴定，不依赖于基于参考质谱图库的质谱图匹配方法。因此，本发明所述近缘微生物鉴定技术可以弥补现有微生物maldi-tofms鉴定方法中因质谱图匹配所引起的近缘微生物鉴定结果混淆的不足之处。

在本发明所述的质谱鉴定方法中，由于微生物培养与差异培养同时进行，并不需要额外的实验时间，相比传统maldi-tofms鉴定方法，本发明鉴定准确度更好，适用于传统maldi-tofms方法不能鉴别的近缘微生物。本发明与传统生化鉴定相比，本发明只需要一个实验，在数分钟内完成，而传统生化鉴定方法需要耗时数小时甚至数日，并且需要多项实验组合验证得出鉴定结果，相比而言，本发明更加快速、简便易行；

具体来说，以志贺菌和大肠埃希菌为例，根据本发明的指导思想，在微生物培养时增加一组含有乳糖的培养基组，与常规培养组一起做maldi-tofms质谱分析，或者是在怀疑志贺菌和大肠埃希菌鉴别结果准确性时，将样品菌落置于含有乳糖的tsb液体培养基中进一步短暂培养数小时，再用maldi-tofms质谱分析，比对图谱，缺少或增加本发明所述特征质谱峰的即为大肠埃希菌，否则为志贺菌。上述方法能正确进一步提高志贺菌和大肠埃希菌的鉴别准确性。

附图说明

图1为本发明一实施例中志贺菌(cmcc51252)在大豆酪蛋白琼脂培养基(tsa培养基)中培养以及在添加1％乳糖的tsa培养基中培养的图谱差异对比图；

图2为本发明一实施例中大肠埃希菌(cmcc44102)在大豆酪蛋白琼脂培养基(tsa培养基)中培养以及在添加1％乳糖的tsa培养基中培养的图谱差异对比图；

图3为本发明一实施例中志贺菌(cmcc51252)在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体tsb培养基)中培养以及在添加6％乳糖的液体tsb培养基中培养的图谱差异对比图；

图4为本发明一实施例中大肠埃希菌(cmcc44102)在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体tsb培养基)中培养以及在添加6％乳糖的液体tsb培养基中培养的图谱差异对比图。

具体实施方式

本发明提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法，其包括如下步骤：步骤1)将试验细菌以菌液的方式在添加乳糖的培养基中培养一预定时间，获得细菌试验样品；步骤2)对步骤1)中获得的细菌试验样品进行细菌蛋白前处理；步骤3)采用质谱仪对步骤2)中处理后的细菌试验样品进行检测，并采集数据；步骤4)对步骤3)采集的数据进行处理与比对分析，以鉴定所述近缘微生物。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为一较佳形式的基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。

在本实施例所述的质谱鉴定方法中，采用的仪器及原材料如下所示：

1.实验仪器

ab4800maldi-tofms高分辨质谱仪，采样软件为4000seriesexplorer4.0数据处理系统，分析软件为dataexplorerv4.5，均购自美国ab-sciex公司；eppendorf5424r台式高速冷冻离心机购自德国艾本德公司；三洋mir-254型号恒温培养箱，购自日本三洋公司。

2.化学试剂

甲醇、乙腈为美国merck公司生产的色谱纯试剂，甲酸为sigma的色谱纯试剂，纯水为millipore系统纯化去离子水。

在本实施例中，所述质谱鉴定方法的具体步骤如下：

(1)细菌培养

试验用细菌工作代菌株储存于-80℃低温冰箱。试验前，取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中，于35℃恒温静置培养24h，制得菌液。将菌液均匀置于不同条件(乳糖浓度不同)培养基中，35℃恒温静置培养一定时间，在生物安全柜中挑取单个菌落，悬浮于装有300μl纯水的1.5ml离心管中，获得细菌试验样品。

(2)细菌蛋白前处理

将装有细菌试验样品的1.5ml离心管置于离心机中，12000g/min离心3min，弃上清，加入50μl70％甲酸水溶液，涡旋混合3min，再加入50μl乙腈，12000g/min离心3min，去上清液1μl点于maldi-tof样品板上。待样品点干燥后再滴加1μl基质，放置干燥后进样。

(3)maldi-tofms检测条件

样品板载入质谱仪后激活激光系统，稳定30min，采用标准蛋白校正仪器，设置激光强度为3200，检测样品点。

(4)数据处理与分析

采用ab公司的4000seriesexplorerv4.5软件对maldi-tofms采集的数据进行对比分析。具体步骤如下：在dataexplorerv4.5软件中同时打开待比对图谱，选择advancedbaselinecorrection，设置参数为2.0，校正图谱基线。选择noisefilter去除图谱噪音，对比图谱。

实施例2

本实施例采用豆酪蛋白琼脂培养基(tsa培养基)作为实验对象，具体为采用的为不含乳糖的tsa培养基以及含乳糖1％的tsa培养基，其鉴定方法如实施例1所述，谱图的对比分析结果如下：

志贺菌(cmcc51252)经过含乳糖1％的tsa培养基培养24h后，maldi-tofms质谱图与不含乳糖的tsa培养基中培养24h的质谱图无显著差异(图1)。大肠埃希菌(cmcc44102)经过含乳糖1％的tsa培养基培养24h后，maldi-tofms图谱中m/z2370.72、m/z2401.04、m/z5757.15的质谱峰强度显著加强(图2)。

实施例3

本实施例采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体tsb培养基)作为实验对象，具体为采用的为不含乳糖的液体tsb培养基以及含乳糖6％的液体tsb培养基，其鉴定方法如实施例1所述，谱图的对比分析结果如下：：

志贺菌(cmcc51252)经过含乳糖6％的液体tsb培养基培养2h后，maldi-tofms质谱图与不含乳糖的液体tsb培养基中培养2h的质谱图无显著差异(图3)。大肠埃希菌(cmcc44102)经过含乳糖6％的液体tsb培养基培养2h后，maldi-tofms图谱中m/z3824.84的质谱峰强度显著加强(图4)。

通过上述实施例可知，志贺菌(cmcc51252)和大肠埃希菌(cmcc44102)在不同条件下培养，志贺菌的maldi-tofms图谱均无显著变化，大肠埃希菌的maldi-tofms图谱则在含乳糖的培养基的处理下4个质谱峰强度上调，说明发生4种蛋白表达显著上升，可理解的是这4种蛋白的分子量可能会因为校正因素、仪器自身因素发生偏移，其分子量为检测值的±5～10da左右；志贺菌(cmcc51252)和大肠埃希菌(cmcc44102)在同浓度含乳糖的培养基处理24h或2h后，志贺菌的maldi-tofms图谱无显著变化，大肠埃希菌的maldi-tofms图谱中m/z2370.72、m/z2401.04、m/z3824.84、m/z5757.15中的至少1个的质谱峰强度显著加强，这表明本发明所述的培养基及鉴定方法为差异图谱鉴别志贺菌和大肠埃希菌提供了实验依据。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。