一种乳品中大肠埃希氏菌的预测模型的制作方法

本发明涉及紫外可见光谱检测技术，特别针对乳品中的大肠埃希氏菌生物浓度的预测模型。

背景技术：

大肠埃希氏菌在自然界有着极为广泛的分布，是一种可致人畜共患病且能引起严重疫情的致病性细菌，牛乳作为人最常食用的乳制品饱受其侵染之害，因此快速高效的测定牛乳中大肠杆菌数量对保障乳制品安全，提高乳品质量，增强我国乳制品的国际竞争力都有着极为重要的意义；目前对牛乳中大肠杆菌总数测定主要依靠:多管发酵法、平板划线法、生物传感器法、聚合酶链式反应法；多管发酵法与平板划线法作为传统的细菌培养检测法耗时往往在48h以上无法作到实时检测；生物传感器法精确度高、特异性强，但目前仍处在实验室阶段无法作到大规模商用，聚合酶链式反应法相较于传统方法有显著优势，其反应时间短、特异性强，但检测所需成本高，人员专业性强；故而对大肠埃希氏菌在乳品中的总数测定在国内外依然空白。

乳品中蕴含丰富的蛋白质胶束和脂肪球，这些生物大分子粒径不一且在乳品中分布不均，同时由于不同结构构型的蛋白质胶束与不同粒径的脂肪球和不同生长时期尺寸不同的大肠埃希氏菌引起的多元散射问题造成散射现象严重，同时大肠埃希氏菌在乳品中的紫外可见光谱会发生红移，致使特征吸收峰偏移既定位置，使光谱法对牛乳中大肠埃希氏菌的定量检测造成较大影响。

技术实现要素：

在下文中给出了本发明的简要概述，以便提供关于本发明的有些方面的基本理解，应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述，他并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围，其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于此，本发明给出了一种针对乳品中大肠埃希氏菌生物浓度定量检测的方法，用于解决目前由于牛乳成分复杂以及生物大分子粒径不一，且在乳品中分布不均引起的多元散射问题，大肠埃希氏菌在乳品中会产生光谱红移，光谱仪器钨光灯能量不稳等因素引起的机械噪声以及特征难以识取，上述问题共同作用造成检测结果的不准确。

本发明给出了一种利用紫外可见光谱法针对乳品中大肠埃希氏菌生物浓度定量检测的方法，整体实验流程包括：将活化后的大肠埃希氏菌接种至玻璃皿中培养至二代菌，在lb肉汤中扩繁二代菌，离心得到纯化后的大肠埃希氏菌，配制出40份不同浓度的待测乳制品菌液，测定菌液的紫外可见光谱；得到200nm-900nm的菌液紫外可见光谱，分析得到紫外可见光区菌液的特征区间在300nm-550nm；因乳品中的生物大分子粒径不一，浓度分布不均引入散射噪声，所以用多元散射法矫正大分子引入的散射；用连续投影法提取300nm-550nm处大肠埃希氏菌在乳品中的特征吸收点；用滑窗平滑法消除高频噪声干扰；用bp神经网络建立预测模型，预测乳品中的大肠埃希氏菌总数，用相关性r²来评价预测模型的预测精度。

进一步地，所述大肠埃希氏菌标准株二代菌培养与扩繁步骤包括：大肠埃希氏菌的菌种活化：用酒精灯外焰对接种丝进行消毒，而后在无菌操作台上用接种丝蘸取适量大肠埃希氏菌于菌株复溶液，取出事先备好的lb培养皿，而后以平板划线法将大肠埃希氏菌接种于lb培养平板，将接种后的lb培养皿放在恒温箱中38℃恒温培养24h，选取完好饱满菌落作为二代菌株用于后期扩繁备用；用接种丝将培养好后的二代菌株菌落划入盛放lb肉汤的50ml试管中，将盛放lb肉汤的50ml试管放入恒温箱中38℃恒温培养24h得到扩繁后的大肠希氏菌；大肠埃希氏菌的纯化：用移液枪将扩繁后的菌液移入离心管中，而后拧紧离心管盖子置于低速离心机内，利用3000r/min低速离心机对扩繁后的大肠埃希氏菌二代菌进行离心，5分钟后取出离心管，吸弃上层清液，用移液枪注入蒸馏水后摇匀，反复上诉过程三次，最终得到纯化后的大肠埃希氏菌。

进一步地，待测菌液制备过程：事先取出40支20ml试管高温消毒，将牛乳放入变温箱80℃放置15min消毒，将纯化后的大肠埃希氏菌以不同浓度加入大肠埃希氏菌，均匀混合后，标号1-40支试管备用。

进一步地，所述菌液紫外可见光谱的获取步骤包括：打开紫外可见分光光度计，预热20min后，以蒸馏水作为基线矫正空白样和对照组，取0.5nm为光谱吸光度间隔，对待测菌液在200nm-900nm波长范围的吸光度进行检算，用移液枪分别吸取不同浓度的染菌乳品5ml于石英比色皿中，每个样品反复测定两次，为防随机误差计算两次测量的平均光谱作为测量的最终结果；本发明共进行了6次试验得到光谱数据168组，经初步筛选最终选取40组作为最终预测建模的初始数据。

进一步地，大肠埃希氏菌在乳品中的特征波段选择：大肠埃希氏菌由蛋白质组成的细胞外壳和被包裹在细胞膜内的遗传物质构成，其中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及遗传物质中的嘌呤和嘧啶都对紫外可见光波段有特异的吸收特性，究其原因是因为这五种物质中都具有特异性的苯环共轭结构，苯环数目随着大肠杆菌浓度增高也不断增高，苯环取代基上不同官能团通过共轭结构影响，产生共轭效应强度增大，特征吸收峰增高，最终吸收带产生红移，因此无法根据先验信息在既定位置找到大肠杆菌在牛乳中的特征吸收峰，需寻求方法以获得红移后的特征波段位置。

进一步地，大肠埃希氏菌在乳品中的特征光谱预处理方法：分析原始光谱得到主要特征吸收波段位于300nm-550nm处，同时考虑到大肠埃希氏菌和乳品在光谱测量时具有较强的散射特性，因为生物大分子与大肠埃希氏菌粒径大小不同，分布不一，故而选取多元散射矫正法(msc)对所得的菌液光谱曲线进行预处理，消除因不同结构构型的蛋白质胶束与不同粒径的脂肪球和不同生长时期尺寸不同的大肠埃希氏菌引起的多元散射问题，对300nm-550nm处的菌液光谱进行连续投影法(spa)，获得最符合大肠埃希氏菌之于紫外可见光谱的吸收峰值，以吸收峰值对应的波段位置进一步精简分析范围，最终将分析范围选定在310nm-450nm；在保证不遗漏大肠埃希氏菌特征同时简化后期预测建模难度。

进一步地，光谱平滑方法：以滑窗平滑法对精简到的310nm-450nm进行平滑，去除随机噪声以及由紫外可见光分光光度计，钨光灯光源能量不稳为光谱曲线带来的影响。

本发明以平板法培养得出的大肠埃希氏菌在乳品中的生物浓度作为对照，构建了以预处理后光谱数据作为初始数据结合bp人工神经网络建立大肠埃希氏菌在乳品中的预测模型。

附图说明

本发明可以通过结合文中附图所给出的描述而更好的理解，其中在所有附图中使用了相同或相似的附图标记来表示相同或者相似的部件；所述附图连同下面的详细说明仪器包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本发明的优选实施例和解释本发明的原理和优点。

图1为本发明实现乳品中，大肠埃希氏菌检测光谱数据处理及bp人工神经网络预测模型建立的流程图。

图2为本发明中乳品内大肠埃希氏菌在200nm-900nm的紫外可见光吸收度原始图。

图3为本发明中乳品内大肠埃希氏菌在300nm-550nm的特征波段光谱图。

图4为本发明中乳品内大肠杆埃希氏菌预处理多元散射矫正(msc)后的光谱图。

图5为本发明中乳品内大肠埃希氏菌应用连续投影法(spa)优选出的特征波图。

图6为本发明中乳品内大肠埃希氏菌滑窗平滑后的光谱图。

图7为本发明中乳品内大肠埃希氏菌检测中特征吸收光谱与总数建立的bp神经网络预测模型图。

本领域技术人员应当理解，附图仅仅是为了简单和清楚起见而示意性地示出的，而不用于对本发明的技术方案进行限制，以便有助于提高对本发明实施例的理解。

具体实施方式

在下文中结合附图对本发明做进一步说明。

本发明提供了一种基于紫外可见光谱法的乳品中大肠埃希氏菌生物浓度的测定方法，具体流程如下：第一步将活化后的大肠埃希氏菌接种至玻璃皿中培养至二代菌，扩繁二代菌，配制出不同浓度的待测乳制品菌液，测定菌液的紫外可见光谱；分析得到在紫外可见光区间菌液的特征区间在300nm-550nm；用多元散射法矫正大分子引入的散射；用连续投影法提取特征吸收点；用滑窗平滑法消除高频噪声干扰；本方法可有效提高特征强度，去除溶剂极性干扰，精准定位大肠埃希氏菌在乳品中的特征吸收峰，去除测定光谱中的高频噪声，矫正因牛乳中生物大分子引起的多元散射问题；最终用bp神经网络建立预测模型，预测乳品中的大肠埃希氏菌总数。

下面结合图1来描述本发明用于乳品中大肠埃希氏菌总数的紫外-可见光谱检测方法的详细处理流程。

如图1所示，流程开始后，第一步执行步骤s110。

在步骤s110中，大肠埃希氏菌标准株活化，二代菌培养、扩繁、纯化，配制成具有一定浓度梯度的大肠埃希氏菌乳品待测样，而后执行步骤s120。

其中二代菌株菌落放入恒温箱中38℃恒温培养24h。

在步骤s120获得不同浓度的待测菌液在200nm-900nm的紫外可见光吸光度光谱，并截取300nm-550nm分析备用，而后执行步骤s130。

其中紫外分光光度计以蒸馏水作为基线矫正空白样和对照组，取0.5nm为光谱吸光度间隔。

在步骤s130中，利用多元散射矫正(msc)，矫正因生物大分子引起的散射问题；然后，执行s140。

其中大肠埃希氏菌和乳品在光谱测量时具有较强的散射特性，因为生物大分子与大肠埃希氏菌粒径大小不同，分布不一，为消除因不同结构构型的蛋白质胶束与不同粒径的脂肪球和不同生长时期尺寸不同的大肠埃希氏菌引起的散射问题引入多元散射矫正法。

在步骤s140中，利用连续投影法(spa)，选定大肠埃希氏菌在乳品紫外光谱中的特征吸收点，同时以滑窗平滑法平滑光谱曲线。

其中，大肠埃希氏菌内色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及遗传物质中的嘌呤和嘧啶都对紫外可见光波段有特异的吸收特性，究其原因是因为这五种物质中都具有特异性的苯环共轭结构，苯环数目随着大肠杆菌浓度增高也不断增高，苯环取代基上不同官能团通过共轭结构影响，产生共轭效应强度增大，特征吸收峰增高，最终吸收带产生红移，因此不能根据先验信息在既定位置找到大肠杆菌在牛乳中的特征吸收峰，需寻求方法以获得红移后的特征波段位置。

在步骤s150中，利用bp神经网络建立大肠埃希氏菌总数与光谱吸收度的预测模型，最终建立了乳品中大肠埃希氏菌的精准预测模型。

以上所述仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围。