一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

背景技术：

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,pcr）是一种体外扩增特定核酸序列的分子生物学技术。核酸扩增技术包括常规pcr、实时荧光定量pcr、等温核酸扩增技术等。常规pcr是基于dna或者rna的pcr技术，被广泛用于基因克隆和鉴定，疾病诊断和基因突变检测。实时荧光定量pcr是指在pcr反应体系中，加入荧光染料或者荧光标记的探针，通过荧光信号的累积实时检测pcr反应进程，利用标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量pcr技术具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，被用于临床疾病诊断、动物微生物疾病检测、食品安全等方面。

pcr反应检测结果的准确性决定于核酸扩增试剂的活性及正确使用。核酸扩增试剂包括各种酶、缓冲液，盐离子、镁离子、寡核苷酸等，进行pcr反应时需要混合所有成分。单个反应体系的多种成分是痕量，操作时会导致一定的实验误差，无法保证实验结果的重复性。在实验过程中，痕量试剂的使用比较容易出现外源性污染。

核酸扩增试剂尤其是酶制剂受温度的影响较大，一般需要低温（-20℃）或者4℃保存，需要干冰运输，且反复冻融会降低酶的活性。在现场化应急性快速检测应用时，常规的冷冻保存实验试剂难以满足实用需求，必须实现对温度敏感的酶试剂进行常温保存。

冻干保护剂具有填充、赋形、稳定的作用，在冷冻和干燥过程中，保护核酸扩增试剂的结构，保持其生物活性。真空冷冻干燥技术可将试剂溶液在较低的温度下冻结成固态，在真空条件下使其中的固态水升华为气态，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水。低温条件下干燥可减少热敏性酶试剂的降解失活，冷冻干燥试剂微球（bead）具有较好的形态和最佳的含水量，操作简便，在常温长期保存下具有生物活性，适合常温运输。核酸扩增试剂冻干微球可应用于临床床边体外诊断、突发传染病的应急处理、检验检疫现场化快速检测等。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是核酸扩增反应试剂的常温保存，提供一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球，其包括：冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。

所述的冻干保护剂包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂。海藻糖的浓度为2~30%；甘露醇的浓度为1~20%；右旋糖苷为dextran10，dextran40或dextran70，浓度为0.4~10%；牛血清白蛋白的浓度为0.1~5mg/ml；表面活性剂为tween20，tween80或者tritonx-100，浓度为0.2~5%；消泡剂的浓度为0.03~1.2%。

所述的缓冲液包括以下一种或者几种成分：tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、氯化钾、氯化镁、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。

所述的酶反应液包括以下一种或者几种试剂：dna聚合酶、尿嘧啶-n-糖基化酶、rna逆转录酶、rna聚合酶、rna酶抑制剂、atp硫酸化酶、单链结合蛋白、无机焦磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、拓扑异构酶、解旋酶、rna酶。

所述的特异性核酸扩增反应试剂包括以下一种或多种试剂：引物、模板、探针、荧光染料。

所述冻干微球的粒径为0.1~5mm。

所述冻干微球的核酸扩增体系为1~200μl。

所述冻干微球用于实时荧光定量pcr、数字pcr、特异性核酸片段扩增、rna逆转录。

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球制备方法，其包括以下步骤：

1)配制核酸扩增反应试剂混合液；

2)将混合液利用精确分液系统控制液滴，滴入液氮中，在液氮中冷却后形成微球；

3)将冷冻微球在-80~-50℃预冷冻1~24小时，转入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。

本发明的有益效果在于：

本发明的冻干保护剂既可保持试冻干后微球的形状，又可保持试剂的生物活性，冻干微球使核酸扩增反应试剂操作简单，减少实验误差，避免污染。冻干微球稳定性较好，灵敏度较高，制备方法比较简单。冻干微球可常温保存，便于运输，利于现场化快速检测应用，方便与全自动核酸检测仪配套使用。

附图说明

图1是本发明冻干微球制备流程的示意图。

图2是本发明实施例1中pcr反应试剂冻干微球的外观。

图3是本发明实施例1中pcr反应试剂冻干微球稳定性检测结果（其中条带m为dnamarker，条带1，3，4，5分别为45℃放置20天，室温放置3个月，37℃放置1个月，55℃放置7天后beads的pcr结果，条带2为对照未冻干试剂的pcr结果）。

图4是本发明实施例2中实时荧光定量pcr反应试剂微球的灵敏度检测扩增曲线结果（三次重复）。

具体实施方式

结合实施例对本发明进一步说明，但并不仅限于此。如无特别说明，本发明中的试剂均为分子生物学级别，“%”均指质量百分比。

实施例1pcr反应试剂冻干微球的制备。

一、pcr反应试剂混合溶液的配制

1)配制混合溶液4ml，其中10×buffer成分为:tris-hcl(ph8.3)100mm，kcl500mm,mgcl220mm;

2)将配制好的混合溶液混匀置于冰上。

二、pcr反应试剂微球的形成

1)利用ivekdigispense3009系统，将6μl混合溶液滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微球；

2)将微球用液氮预冻的小勺取出，装入-80℃预冻的西林瓶中。

三、微球的真空冷冻干燥

将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冻干，程序如下：

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四、冻干微球的形态学检测

1)外观检测

beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好。实验结果如图1所示；

2)冻干微球的直径

利用游标卡尺测得冻干beads的直径如下表1；

表1

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五、冻干微球的稳定性检测

1)在湿度小于30%，将beads放置室温3个月、37℃1个月、45℃20天、55℃7天;

2)以m5hiperptopo-t载体为模板，扩增2kb目的片段，引物序列为：上游引物f-2k（5'-3'）：tagctgtttcctgtccatag，下游引物r-2k（5'-3'）ctggccgtcgttttacacaa，如下配制检测溶液:

3)配制阳性对照:

4)将混合好的检测溶液取30μl加入含有bead的pcr管中;

5)混合均匀后，离心，放入pcr仪，设置反应条件为98℃5min；30cycles（98℃10s，55℃30s，72℃2min10s）；72℃10min；

6)反应结束后，取5μl上样，1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果如图2所示。

图2pcr结果显示，在室温到55℃条件下保存，冻干微球的活性受温度影响较大，随温度的升高而降低。室温条件下保存3个月，与未冻干试剂比较，冻干微球具有较好的生物活性。

实施例2实时荧光定量pcr反应试剂冻干微球的制备。

一、实时荧光定量pcr反应试剂混合溶液的配制

1)设计引物序列为：上游引物forwardprimer（5'-3'）：cagactaaactggctgacggaat，下游引物reverseprimerr（5'-3'）：cagtggtgagtaaccatgcatcat；配制混合溶液4ml，其中10×buffer成分为：tris-hcl（ph8.3）100mm，kcl500mm,mgcl220mm；

2)将配制好的混合溶液置于冰上。

二、实时荧光定量pcr反应试剂微球的形成

方法如实施例1步骤二。

三、微球的真空冷冻干燥

将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冻干，程序如实施例1步骤三。

四、冻干微球的形态学检测

1)外观检测

beads为球形，表面较光滑，分散性好，完整性很好；

2)冻干微球的直径

利用游标卡尺测得冻干beads的直径如下表2；

表2

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五、冻干微球的灵敏度检测

1)将beads室温放置2个月；

2)以pet-30a载体为模板，扩增100bp目的片段，taqman探针t（5'-3'）：tgcctcttccgaccatcaagcattttatc，10μm探针t10μl，超纯水490μl配制混合溶液；

3)将混匀的溶液29μl加入含有bead的pcr管中；

4)分别加含pet-30a1.8×10³、1.8×10⁴、1.8×10⁵、1.8×10⁶、1.8×10⁷1μl模板溶液至含bead的pcr管中，每个模板梯度设置三个重复；

5)混合均匀后，离心，abi7500进行荧光定量pcr，设置反应条件95℃5min；40cycles（95℃10s，60℃45s）；

6)实时荧光定量pcr的ct值如表3，扩增曲线结果如图3所示；

表3

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表3和图3结果显示，室温保存2个月后，冻干微球的荧光定量ct值重复性较好，灵敏度也比较高。