一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物与流程

本发明涉及生物领域，具体涉及一种qpcr方法，尤其涉及一种通用qpcr质粒定量方法及通用引物。本发明可通用于绝大部分工业发酵生产质粒dna的qpcr定量，也可用于以这些质粒dna为原料生产的产品（如病毒）中质粒dna残留定量。

背景技术：

质粒dna是细胞免疫疗法、基因疗法等新兴生物制药领域的重要原材料或产品成分。质粒dna的工业生产使用大肠杆菌发酵然后纯化得到高纯度的质粒dna，为了优化生产工艺以及对生产用大肠杆菌菌种进行质量检测，需要检测大肠杆菌中质粒拷贝数；对于以这些质粒dna为原料生产的产品（如病毒），也需要对其进行质粒dna残留的检测（qpcrdna残留检测要求扩增片段尽可能小）。常规qpcr定量方法需要针对不同的质粒分别设计特异引物/探针并验证其特异性与扩增效率。

本领域亟需研发一种可通用于绝大部分工业发酵生产质粒dna的qpcr质粒定量方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题之一是提供一种通用qpcr质粒定量方法，该方法可作为一种通用的质粒dna定量方法，且由于扩增片段仅50bp，也可将其用于以质粒dna为原料生产的产品（如病毒）中质粒dna残留定量。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于qpcr质粒定量的通用引物。

为解决上述技术问题，本发明设计思路如下：为了提高产量，目前几乎所有工业生产的质粒dna均携带高拷贝复制起始位点（ori），使用中、高拷贝的puc、pmb、pbr322等骨架设计构建而成，而这些中、高拷贝质粒骨架的ori均可追溯至天然质粒pcole1，具有高度同源性，本发明针对这些质粒的高度同源序列设计qpcr引物（扩增片段长度仅50bp），并验证其在大肠杆菌中可特异扩增。

本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供了一种通用qpcr质粒定量方法，包括如下步骤：

步骤1，寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qpcr引物；

步骤2，设计引物时排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增片段较小的qpcr引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域，即序列完全一致区域；

步骤3，进行sybr-greenqpcr实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热融解曲线；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测，根据热融解曲线验证其在大肠杆菌基因组存在时的特异性。

作为本发明优选的技术方案，步骤1中，所述常用工业生产质粒骨架包括常用中、高拷贝质粒骨架pbr322、puc系列，常用原核表达载体pet系列、pgex系列，常用克隆载体pgem系列，常用噬菌体展示载体pbluescript系列；选用以上系列质粒中的一种作为代表进行多序列比对。

作为本发明优选的技术方案，步骤2中，设计的引物序列与扩增片段序列如下：

pori-f：5’-ctcgtgcgctctcctgttc-3’，如seqidno:1所示；

pori-r：5’-gcggacaggtatccggtaag-3’，如seqidno:2所示；

扩增片段序列：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如seqidno:3所示。

作为本发明优选的技术方案，所有包含seqidno:3所示扩增片段序列的质粒均能使用该通用qpcr质粒定量方法进行定量检测，包括但不限于所述的系列质粒及以其为骨架构建的重组质粒。所述方法能用于这些质粒载体构建的重组质粒的定量。

作为本发明优选的技术方案，所述引物的pcr产物为50bp。

作为本发明优选的技术方案，所述方法能用于以这些质粒dna为原料生产的产品中质粒dna残留定量。

作为本发明优选的技术方案，步骤3中，所述进行sybr-greenqpcr实验验证引物具体为采用步骤2设计的引物进行pcr扩增反应，pcr扩增反应程序如下：

步骤195℃10min；

步骤295℃15s；

步骤360℃60s；

步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；

步骤495℃15s；

步骤560℃60s；

步骤6以0.05℃/s的速度升温至95℃，并接收荧光信号。

作为本发明优选的技术方案，步骤3中，所述进行sybr-greenqpcr实验验证引物具体为采用步骤2设计的引物进行pcr扩增反应，qpcr反应体系中引物终浓度为250nm。

在本发明的第二方面，提供用于qpcr质粒定量的通用引物，所述通用引物序列为：

pori-f：5’-ctcgtgcgctctcctgttc-3’，如seqidno:1所示；

pori-r：5’-gcggacaggtatccggtaag-3’，如seqidno:2所示；

其对应的扩增片段序列为：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc，如seqidno:3所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的qpcr引物针对工业生产质粒高度同源区域设计，扩增效率高、定量线性好、特异性好。本发明为通用qpcr方法，不需再花费人力物力针对不同的质粒分别单独设计qpcr引物并验证，且pcr产物仅50bp，也可用于以质粒dna为原料生产的产品（如病毒）中质粒dna残留定量。

附图说明

图1为本发明实施例2中的qpcr标准曲线扩增图谱。

图2是本发明实施例2中大肠杆菌基因组与质粒qpcr标准曲线参数图，其中，genome为大肠杆菌基因组qpcr标准曲线；plasmid-ori为本发明质粒qpcr标准曲线。

图3是本发明实施例2中大肠杆菌基因组与质粒热融解曲线图，其中，右侧温度较高的峰为本发明qpcr方法热融解曲线，左侧较低的峰为大肠杆菌基因组热融解曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例1引物设计

1)多序列比对寻找共有高度同源序列

选取常用的中、高拷贝质粒骨架pbr322（常用质粒骨架）、puc18（代表puc系列质粒，常用质粒骨架）、pet-28-a（代表pet系列质粒，常用原核表达载体）、pgex-6p-1（代表pgex系列质粒，常用原核表达载体）、pbluescriptiisk+（代表常用噬菌体展示质粒）、pgem-t（代表常用克隆载体），以及pcole1（天然质粒，中、高拷贝质粒原始来源），进行多序列比对，各质粒序列信息来源如表1，多序列比对得到高度同源序列见表2（常用质粒高度同源序列，“pcole1rc”与“pgex-6p-1rc”中“rc”表示反向互补序列），该高度同源区域实际为ori。

表1质粒序列信息来源

表2常用质粒高度同源序列

2)设计通用特异引物

根据多序列比对结果选择高度同源区域（见表2），使用ncbiprimerdesigningtool设计引物，排除在人（taxid:9606）基因组与大肠杆菌（taxid:562）基因组中可能发生非特异反应的引物，最终筛选得到评分较高，且扩增片段为同源序列中完成一致50bp区域的高特异性引物

引物与扩增片段序列（5’→3’）如下：

pori-f（seqidno:1）：ctcgtgcgctctcctgttc

pori-r（seqidno:2）：gcggacaggtatccggtaag

扩增片段序列（seqidno:3）：ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc

seqidno:3即表2中的“ori-pcr”，加星标注明，为多序列比对中完全一致区域。

实施例2sybr-greenqpcr验证引物：

大肠杆菌基因组引物（5'-gcgagcgatccagaagatct-3'，5'-gggtaaaggatgccacagaca-3'，来源自参考文献https://link.springer.com/article/10.1186/1475-2859-7-6）已经过验证，符合qpcr定量要求。通用qpcr质粒引物由实施例1设计并得到。

1)配制qpcr反应混合液（基因组引物与本发明通用质粒引物终浓度均为250nm），见表3：

表3

2）标准品及待测样品制备

以含目的序列质粒和大肠杆菌基因组标准品分别10倍梯度稀释作为标准曲线。质粒与基因组均选取0.5×10²至0.5×10⁷copies/μl作标准曲线。

稀释大肠杆菌至适当的浓度（od600=0.001）作为待测样品。

3）qpcr反应体系配制（含模板），3复孔，见表4。

表4

4）将配制好的反应体系加入96孔板，每个反应体系3个复孔，20μl/孔。

5）按如下程序运行：

步骤195℃10min；

步骤295℃15s；

步骤360℃60s；

步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；

步骤495℃15s；

步骤560℃60s；

步骤6以0.05℃/s的速度升温至95℃，并接收荧光信号。

6）数据分析

图1为qpcr标准曲线扩增图谱，从左至右分别为10⁷至10²copies/μl。

图2为大肠杆菌基因组与质粒qpcr标准曲线参数，本发明的质粒qpcr引物扩增效率为105.802%、线性相关系数r²为0.998。

图3为大肠杆菌基因组与质粒热融解曲线，均为单峰，说明本发明的质粒通用qpcr引物在大肠杆菌中不受大肠杆菌基因组dna的干扰，仅发生特异性pcr反应。

实验证明，本发明针对中、高拷贝质粒高度同源ori区域设计通用qpcr引物，扩增效率高，特异性好，且预测其在大肠杆菌（taxid:562）基因组（已验证）和人（taxid:9606）基因组不发生非特异反应。pcr产物仅50bp，因此也可用于以这些质粒dna为原料生产的产品（如病毒）中质粒dna残留定量。理论上所有包含扩增片段序列（seqidno:3）的dna均可使用本qpcr方法进行定量检测。包括但不限于常见中、高拷贝质粒骨架pbr322、puc系列，常用原核表达载体pet系列、pgex系列，常用克隆载体pgem系列，常用噬菌体展示载体pbluescript系列，以及基于这些质粒载体构建的重组质粒的定量和以这些质粒为原料生产的产品中质粒dna残留定量。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>无锡生基医药科技有限公司

<120>一种通用qpcr质粒定量方法及通用引物

<130>wh-np-19-100255

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ctcgtgcgctctcctgttc19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gcggacaggtatccggtaag20

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>3

ctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc50