一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法与流程

本发明涉及食品及乳品中维生素b12测定
技术领域：
，具体涉及一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法。
背景技术：
：维生素b12是迄今为止人类发现最晚的一种b族维生素，对它的研究任然不够充分。维生素b12是一类化合物的统称，具有多种存在形式，如氰钴胺素（cyanocobalamin）、羟钴胺素（hydroxocobalamine）、甲钴胺素（mecobalamine）和5′-脱氧腺苷钴胺素（5′-deoxyadenosylcobalamin）等，由于维生素b12自身具有多种分子构造和差异化的生物效价，使得食品中维生素b12的检测成为技术上的难点，尤其在微量存在水平的食品中，使用人工合成或天然维生素b12均存在巨大的检测误差，严重影响了行业的发展与技术进步。国内外现有的测定方法都存在明显的技术局限,如文献报道的分光光度法、高效液相色谱/质谱法、电泳法、离子交换法和等离子发射光谱法等化学分析法，以有限的各别结构含量代表维生素b12总量，缺乏令人信服的理论支持；微生物检测法理论相对完整，但最终测量的是微生物代谢物产生的溶液混浊度，属于典型的模拟信号，导致即便微弱的色差或杂质就能干扰结果，可操作性极差。因此，维生素b12至今缺少实用完善的测定方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法，旨在解决现有维生素b12检测方法可操作性低、重复性差的缺点的问题。为实现上述目的本发明采用的技术方案是：一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法，包括如下步骤：（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；（2）、微生物对食品中维生素b12的增值转换：将食品中维生素b12转化为特定营养因子添加于测定用培养基，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；（4）、总dna的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌dna提取试剂提取待测液的总dna，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；（5）、dna定量检测：采用微滴式数字pcr进行结果分析，获得dna拷贝数（y）；（6）、计算检测结果；样品维生素b12含量（x）与dna拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素b12和对应dna拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素b12含量。进一步，所述步骤（2）中，莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25μl添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养20h。进一步，所述步骤（3）中，灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃±1℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃±1℃。进一步，所述步骤（5）中，采用微滴式数字pcr进行结果分析按如下步骤完成：1）、配置反应体系：10μlddpcrmastermix（2x），上下游引物各1.0μl，2.5μl探针，4.5μlddh2o，1μlcdna模板，反应总体积为20μl。并用去离子水代替模板作为阴性对照；2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到dg8cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（dgoil），时长2分钟后生成微滴；3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的px1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s；4）、pcr反应：程序：37℃保温10min，95℃预变性10min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，98℃延伸15s，40个循环，最后98℃延伸5min，降至室温；5）、获取dna拷贝数：将完成pcr的96孔板放入plateholder中组装好并放入微滴读取仪中，打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，进行qx200实验，得到dna拷贝数（y）。本发明的有益效果是：本发明在微生物方法基础上引入定量dna技术，最大程度延伸了微生物方法对具有生物活性的维生素b12高度灵敏的优势，同时规避了微生物法可操作性低、重复性差的缺点，本发明可操作性强，反映的是基质中总的维生素b12含量，优于只能针对某种特定结构维生素b12的仪器分析方法。附图说明图1为本发明中由维生素b12和对应工作菌株dna含量构成的散点图。具体实施方式以下结合优选实施方式对本发明作进一步说明：一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法，包括如下步骤：（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；相较于常规微生物检测维生素b12，由于无需采用现有微生物方法中的透光率检测原理，因此无需进行肉汤培养二次增值，可简化操作工艺。（2）、微生物对食品中维生素b12的增值转换：将食品通过高温水解、沉淀和过滤等方法除去蛋白、脂肪和淀粉等干扰物质，保留的维生素b12作为特定营养因子用于莱士曼氏乳酸杆菌特异性增值培养，食品中维生素b12转化为特定营养因子后添加于测定用培养基；取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25μl添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内进行增值，恒温培养控制36℃±1℃培养20h；该菌的增值量与食品中维生素b12成对应关系。（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液试管进行灭活操作；具体的灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃，或68℃±1℃环境中保温30min以后急速冷却到4℃±1℃；这样可使细菌停止生理活性避免后期数量波动，同时保持细胞线粒体中16srdna结构完整。（4）、总dna的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌dna提取试剂提取待测液的总dna，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；通过浓度和纯度可判定总dna的提取是否成功。（5）、dna定量检测：采用微滴式数字pcr进行结果分析，获取dna拷贝数（y）；具体实现步骤是：1）、配置反应体系：10μlddpcrmastermix（2x），上下游引物各1.0μl，2.5μl探针，4.5μlddh2o，1μlcdna模板，反应总体积为20μl。并用去离子水代替模板作为阴性对照；其中leichmanniif：gaagcaacgcgaagaaccttacca，leichmanniir：acttaacccaacatctcacgacac，leichmannii-probe：fam-ctacgcattccaccgctacaca-mgb；2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到dg8cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（dgoil），时长2分钟后生成微滴；3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的px1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s；4）、pcr反应：程序：37℃保温10min，95℃预变性10min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，98℃延伸15s，40个循环，最后98℃延伸5min，降至室温；5）、获取dna拷贝数：将完成pcr的96孔板放入plateholder中组装好并放入微滴读取仪中，打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，进行qx200实验，得到dna拷贝数（y）。（5）、计算检测结果；样品维生素b12含量（x）与dna拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素b12和对应dna拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素b12含量。其中，标准液获取的维生素b12含量和dna拷贝数的回归方程可通过如下方式获得：①、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；②、精密配制维生素b12标准品工作液,加水稀释至含维生素b12质量浓度分别为0,0.0005,0.001,0.002,0.004,0.008,0.016,0.032,0.064,0.128ng/ml的系列标准品溶液，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25μl添加于121℃灭菌5min的上述标准品溶液的试管中，然后将试管放入恒温培养箱内进行增值，恒温培养控制36℃±1℃培养20h；③、吸取1ml标准品工作菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌dna提取试剂提取溶液的总dna，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；④、按照上述步骤5）的操作方法进行dna定量检测，并获取dna拷贝数（含量）；维生素b12不同质量浓度下对应检测出的dna拷贝数见下表；vb12含量（x）ng/ml00.0010.0020.0040.0080.0160.0320.0640.128dna含量（y）copies/ml861702986741296266053601136023720⑤、根据步骤④中表格实测数据，由excel生成图谱及线性公式和对应r2；主要利用excel生成xy（散点图），可获得回归方程为：y=184575x-160，线性相关系数r2=0.999；具体详见说明书附图1。本发明利用莱士曼氏乳酸杆菌（lactobacillusleichmannii）对维生素b12的特异性和灵敏性，在测定用培养基中供给除维生素b12以外的所有营养成分，这样微生物生长就会同待测食品中维生素b12的含量相对应，通过pcr方法定量检测微生物含量，可计算出原食品中维生素b12的含量。本发明采用dna检测技术并利用标准量的维生素b12获取对用的dna含量，进而获得回归方程及线性相关系数，其中线性相关系数r2可达到0.999，由此可见本发明方法具有更好的方法稳定性和准确性。当前第1页12