本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种汉黄芩素抑制sgk1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法。
背景技术：
p53蛋白的动力学行为已经被证实是决定细胞命运的关键因子，如细胞周期抑制、细胞衰老、凋亡等。细胞内的sgk1与p53之间存在一个负反馈调节通路，sgk1表达量与p53蛋白水平密切相关。那么细胞内的sgk1蛋白的表达也存在与p53波动类似的能够导致不同细胞命运的动力学现象，影响sgk1的表达也能够相应地调控肿瘤细胞命运。
技术实现要素：
本发明的目的：提供根据肿瘤的情况找到合理的用药方法，它可以确保在两次用药之间汉黄芩素的浓度在细胞或组织略高于可以诱导细胞从细胞周期阻滞进入细胞衰老状态，或者诱导肿瘤细胞衰老进入细胞凋亡状态。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种汉黄芩素抑制sgk1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法，包括如下步骤：
步骤1：人类非小细胞肺癌细胞培养：将人类非小细胞肺癌细胞培养于加入3ml含10％fbs的rpmi-1640完全培养基中，rpmi-1641培养基培养于37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中；
步骤2：细胞传代：当细胞生长融合度80％-90％左右，将细胞培养瓶用酒精擦拭后移入超净台，弃去旧培养液，用pbs缓冲液冲洗涤细胞两遍；加入1ml胰酶消化后，在显微镜下观察细胞形态。当细胞体积缩小变圆、间隙变大时，加入3ml含有10％fbs的rpmi-1640培养基；
步骤3：细胞活力分析：收集对数生长期的细胞，调节细胞密度，每孔加入约5000个细胞，加入96孔板，每孔100μl；当细胞融合度达80-90％时，加入汉黄芩素的药物终浓度分别为0、5、10、20、40、80μm；汉黄芩素作用12h取出细胞，每孔加入10μlcck8溶液，培养2h后，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度(od)值；每组设定3个复孔，重复实验3次并取平均值；
步骤4：细胞衰老检测：收集对数期生长的细胞，接种于六孔板内，细胞融合度达到80-90％时开始按不同时间点加入基础培养基溶解的汉黄芩素，样品准备完成。吸除细胞培养液，用pbs洗涤2次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟；吸除染色固定液，用pbs洗涤3次，每次3分钟；吸除pbs，每孔加入1ml染色工作液。用封口膜封住6孔板后置于37℃温箱孵育；最后，使用普通光学显微镜观察细胞的衰老状况；
步骤5：细胞凋亡检测：细胞培养基吸出至15ml离心管内，pbs洗涤贴壁细胞一次，加入0.5ml胰酶细胞消化细胞；将细胞悬液加入步骤1中收集的细胞培养液1000g离心5min，使用pbs轻轻重悬细胞并且计数；取100000个重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μlannexinv-fitc结合缓冲液轻轻重悬细胞；加入5μlannexinv-fitc液体混匀；加入10μl碘化丙啶染色液混匀；室温避光孵育20min，然后置于冰浴中。并使用流式细胞仪检测对细胞进行凋零检测；
步骤6：细胞周期检测：收集细胞培养液到一离心管内备用。使用0.5％的胰酶消化细胞，加入细胞培养液并吹打下全部的贴壁细胞；重悬细胞并再次收集至离心管中；1000g左右转速进行3-5分钟的离心以沉淀细胞；加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞，并转移至1.5ml的离心管内；将1ml冰浴预冷的70％乙醇加入细胞中，轻轻吹打均匀，4℃固定约2小时；每一管细胞样品中加入0.5ml的碘化丙啶染色液，37℃温箱避光温浴30分钟；用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，采用modifit分析软件进行细胞dna含量分析和光散射分析。
综上所述，本发明的有益效果在于，通过不同的汉黄芩素给药方法，能诱导非小细胞肺癌细胞进入细胞周期阻滞、细胞衰老和细胞凋亡的不同细胞状态，因此肿瘤细胞可以从一种命运的转移到另一种命运，以减少盲目使用大剂量化疗药物带来的毒副作用，为临床合理用药提供参考依据。
具体实施方式
结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
一种汉黄芩素抑制sgk1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法，包括如下步骤：
步骤1：人类非小细胞肺癌细胞培养：将人类非小细胞肺癌细胞培养于加入3ml含10％fbs的rpmi-1640完全培养基中，rpmi-1641培养基培养于37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中；
步骤2：细胞传代：当细胞生长融合度80％-90％左右，将细胞培养瓶用酒精擦拭后移入超净台，弃去旧培养液，用pbs缓冲液冲洗涤细胞两遍；加入1ml胰酶消化后，在显微镜下观察细胞形态。当细胞体积缩小变圆、间隙变大时，加入3ml含有10％fbs的rpmi-1640培养基；
步骤3：细胞活力分析：收集对数生长期的细胞，调节细胞密度，每孔加入约5000个细胞，加入96孔板，每孔100μl；当细胞融合度达80-90％时，加入汉黄芩素的药物终浓度分别为0、5、10、20、40、80μm；汉黄芩素作用12h取出细胞，每孔加入10μlcck8溶液，培养2h后，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度(od)值；每组设定3个复孔，重复实验3次并取平均值；
步骤4：细胞衰老检测：收集对数期生长的细胞，接种于六孔板内，细胞融合度达到80-90％时开始按不同时间点加入基础培养基溶解的汉黄芩素，样品准备完成。吸除细胞培养液，用pbs洗涤2次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟；吸除染色固定液，用pbs洗涤3次，每次3分钟；吸除pbs，每孔加入1ml染色工作液。用封口膜封住6孔板后置于37℃温箱孵育；最后，使用普通光学显微镜观察细胞的衰老状况；
步骤5：细胞凋亡检测：细胞培养基吸出至15ml离心管内，pbs洗涤贴壁细胞一次，加入0.5ml胰酶细胞消化细胞；将细胞悬液加入步骤1中收集的细胞培养液1000g离心5min，使用pbs轻轻重悬细胞并且计数；取100000个重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μlannexinv-fitc结合缓冲液轻轻重悬细胞；加入5μlannexinv-fitc液体混匀；加入10μl碘化丙啶染色液混匀；室温避光孵育20min，然后置于冰浴中。并使用流式细胞仪检测对细胞进行凋零检测；
步骤6：细胞周期检测：收集细胞培养液到一离心管内备用。使用0.5％的胰酶消化细胞，加入细胞培养液并吹打下全部的贴壁细胞；重悬细胞并再次收集至离心管中；1000g左右转速进行3-5分钟的离心以沉淀细胞；加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞，并转移至1.5ml的离心管内；将1ml冰浴预冷的70％乙醇加入细胞中，轻轻吹打均匀，4℃固定约2小时；每一管细胞样品中加入0.5ml的碘化丙啶染色液，37℃温箱避光温浴30分钟；用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，采用modifit分析软件进行细胞dna含量分析和光散射分析。
结果分析：
不同浓度汉黄芩素作用下细胞活力检测结果，在汉黄芩素20μm和40μm之间细胞活力出现明显下降(p<0.05)；在汉黄芩素20μm浓度下不同时间点的细胞活力的结果，在8h和10h之间出现明显下降(p<0.05)。
结果表明，非小细胞肺癌细胞在受到外界药物刺激发生dna损伤后，sgk1蛋白的表达呈现出波动动力学变化，这种动力学变化与肿瘤细胞的细胞命运密切相关，sgk1是参与决定细胞命运的重要因子。药物被细胞摄取进入细胞内的速度、暴露时间等药动学参数的差异决定了不同的sgk1波动动力学行为，包括sgk1的波动峰值、波动周期、波动频率等，进而影响肿瘤细胞的细胞命运。sgk1的蛋白表达在非小细胞肺癌(nsclc)细胞dna损伤后表现出波动的动态变化是由外部诱导药物汉黄芩素刺激产生的；sgk1在三种不同的细胞状态下的动态的动力学波动存在显著差异但sgk1的蛋白表达的曲线下面积无明显差别，提示不是由于累积的sgk1蛋白总量的差别而是不同的蛋白动力学水平导致的三种不同的细胞命运；sgk1是参与细胞命运的抉择的一个重要因子。
综上所述，本发明的有益效果在于，通过不同的汉黄芩素给药方法，能诱导非小细胞肺癌细胞进入细胞周期阻滞、细胞衰老和细胞凋亡的不同细胞状态，因此肿瘤细胞可以从一种命运的转移到另一种命运，以减少盲目使用大剂量化疗药物带来的毒副作用，为临床合理用药提供参考依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。