本发明涉及药物筛选技术领域，特别涉及一种药物化合物高通量筛选方法。
背景技术：
创新药物筛选需要药物化学、药理、药物代谢、毒理学以及制剂等多学科共同配合。当前的创新药物从头研发常常是几个学科序贯进行，药物化学应用组合化学技术根据靶标结构设计合成大量化合物，药理学科应用高通量筛选技术进行活性的快速评价进而筛选出苗头化合物，药物代谢及毒理学应用早期药物代谢和发现毒理学技术平台配合进行高通量评价进一步确定出先导化合物，这种模式下虽然促进了新药研发的速度和成功率，仍存在一些重要问题。由于各个学科技术平台相对独立，整轮筛选耗时较长、需要化合物量较大，存在资源和时间浪费，而在新药研发过程中时间不仅是金钱，更重要的是只有更快地为患者提供好药、解救病痛才是新药研发的宗旨。
高通量筛选是当前创新药物发现的重要模式，但高通量筛选一般仅考虑活性评价，即应用表达的酶、受体、离子通道、核酸、以及细胞等非代谢活性体系作为筛选模型评价化合物对已知靶标的结合、抑制等特异作用，作为药物筛选的起点，筛选出的化合物虽然具有靶标结合活性，但还远远不能成为药物。决定化合物能否成为药物不仅仅决定于其活性，药物代谢稳定性也至关重要。代谢稳定性可决定药物生物利用度、半衰期，因此代谢稳定性是决定化合物能否成为药物的重要特征之一。
目前常规的药物高通量筛选一般在96-384孔板中将筛选化合物与靶标受体、酶等同时孵育，孵育体系中加入同位素标记的竞争性抑制剂，或孵育结束后应用添加荧光染料、荧光报告蛋白等方法对化合物与酶结合物进行高通量放射活性或荧光检测，快速确定化合物是否具有靶标抑制或激活作用来筛选药效活性，未考虑药物在体内环境中都是存在于代谢活性环境中，因此评价出的化合物作为药物的成功率大打折扣。
技术实现要素：
本发明为克服传统高通量筛选仅关注靶标活性的问题，提供了一种药物化合物高通量筛选方法，该方法筛选出的化合物具有药理活性和代谢稳定性的双重优势，将大大提高药物高通量筛选的成功率。
本发明的技术方案如下：
本发明药物化合物高通量筛选方法，包括以下步骤：
将待筛选的化合物加入高通量筛选用孵育体系中进行孵育，所述孵育体系中包括特异性靶标受体、肝微粒体或者肝s9，平行设置加入和不加nadph反应因子的两组；测定化合物在不加入nadph和加入nadph的孵育体系中孵育后对靶标受体的抑制活性，得到两条活性抑制曲线；
根据所述活性抑制曲线判断待筛选化合物，若两条活性抑制曲线重合，则化合物的稳定性和成药性好；若相对于未加入nadph体系的活性抑制曲线，加nadph体系的活性抑制曲线右移，则化合物的稳定性和成药性差；若相对于未加入nadph体系的活性抑制曲线，加nadph体系的活性抑制曲线左移，则提示化合物在体内可经代谢活化成活性代谢物。
优选的，所述特异性靶标受体为阿片受体或胰高血糖素受体。
优选的，所述待筛选化合物经系列稀释后加入孵育体系中孵育。
更优选的，所述待筛选化合物在孵育体系中的浓度为10-12～10-2mol/l。
优选的，所述肝微粒体在孵育体系中的浓度为0.2～0.5mg/ml，所述肝s9在孵育体系中的浓度为0.5～1.0mg/ml，所述nadph在孵育体系中的浓度为1～2mm。
优选的，所述孵育体系在加入nadph前先预孵育3～10min，加入nadph后再继续孵育10～60min。
优选的，所述孵育的温度为36～38℃。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明药物化合物高通量筛选方法，在传统的药物高通量活性筛选孵育体系中加入肝微粒体/肝s9及nadph。肝微粒体/肝s9中含有主要的i相药物代谢酶，通过氧化还原反应将药物进行代谢转化，nadph是重要的启动氧化还原反应的辅助因子。肝微粒体/肝s9及nadph作为代谢活性体系，模拟体内药物作用环境，使一轮筛选出的化合物既具有对靶标作用的活性同时具有较好代谢稳定性，淘汰掉没有活性及代谢不稳定化合物，大大提高筛选出化合物的成药性，同时还可能发现活性代谢产物，发现新的候选化合物，是发现新化合物的重要途径之一。
附图说明
图1为本发明筛选方法可能出现的几种筛选结果；
图2～6分别为实施例1中待筛选化合物zbh1#,2#,3#,4#,5#在加入和不加入药物代谢酶时得到的抑制阿片受体活性的两条抑制曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种药物化合物高通量筛选方法，旨在将药效靶标活性筛选和代谢稳定性筛选结合起来，该方法包括以下步骤：
将待筛选的化合物加入高通量筛选用孵育体系中进行孵育，所述孵育体系中包括特异性靶标受体、肝微粒体或者肝s9，平行设置加入和不加nadph反应因子的两组；测定化合物在不加入nadph和加入nadph的孵育体系中孵育后对靶标受体或酶的抑制活性，得到两条活性抑制曲线；
根据所述活性抑制曲线判断待筛选化合物，若两条活性抑制曲线重合，则化合物的稳定性和成药性好；若相对于未加入nadph体系的活性抑制曲线，加nadph体系的活性抑制曲线右移，则化合物的稳定性和成药性差；若相对于未加入nadph体系的活性抑制曲线，加nadph体系的活性抑制曲线左移，则提示化合物在体内可经代谢活化成活性代谢物。
本发明所述待筛选的化合物在筛选时优选将所述化合物稀释为系列浓度进行筛选，所述稀释后的浓度优选为10-12～10-2mol/l，更优选为10-10～10-4mol/l。本发明原则上对药物的类别没有限定，所有的药物化合物都能够采用本发明的方法进行筛选。
本发明中对特异性靶标受体的种类没有特殊限定，本领域技术人员可以根据研究目标化合物的性质设置靶标受体的种类，如阿片受体或胰高血糖素受体等。阿片受体是针对研究开发镇静、镇痛、戒毒等药物的靶标受体。本发明所述靶标受体能够与待筛选的化合物反应，根据化合物与靶标受体反应的效果筛选得到对靶标受体有一定活性的药物化合物。
本发明在孵育体系中还加入了肝微粒体或肝s9，优选为人肝微粒体或人肝s9。人肝微粒体和人肝s9中含有药物代谢酶，可模拟体内环境对药物进行代谢转化。本发明所述肝微粒体优选为0.2～0.5mg/ml，更优选为0.3～0.4mg/ml。肝s9的浓度优选为0.5～1.0mg/ml，更优选为0.8～1.0mg/ml。
本发明平行设置加入和未加入nadph的孵育体系，当在孵育体系中加入了nadph时，优选所述nadph在孵育体系中的浓度为1～2mm。加入nadph后药物代谢酶活性即被激活，孵育体系中同时具有检测化合物与靶标受体结合或抑制作用以及代谢稳定性反应能力。
本发明中，所述待筛选的化合物在高通量筛选的孵育体系中进行孵育，优选孵育温度为36～38℃，更优选为37℃；所述孵育体系在加入nadph前优选先预孵育3～10min，更优选预孵育5～8min，加入nadph后再继续孵育10～60min，更优选为30～40min。
孵育后测定不同浓度药物竞争性，结合放射性同位素标记底物与靶标受体的能力用绘图软件prism拟合绘制竞争性活性抑制曲线。本发明所述活性抑制曲线的制备方法采用本领域技术人员所熟知的方法，具体为以系列药物浓度对数值为坐标横轴、对应的竞争结合能力(％)为纵轴，拟合抑制曲线。
根据未加入和加入nadph得到的两组活性抑制曲线，根据抑制曲线判断药物化合物的靶标结合活性及代谢稳定性。
假设abcde五个化合物在高通量活性筛选中活性相当，具有同级别的抑制能力，但如果加入肝微粒体/肝s9及nadph的代谢活性体系同时筛选，可出现以下几种结果(见图1)：
1)化合物a的靶标结合反应没有因加入代谢酶源受到影响，两条曲线重合，a化合物的成药性最好；
2)化合物b具有一定的代谢稳定性问题，因药物原型降解实际浓度有所降低，出现活性抑制曲线的轻度右移；以此类推，化合物c的成药性比b差，化合物d的成药性最差；
3)化合物e加入nadph的抑制曲线出现了左移，提示化合物e在体内可经代谢活化成活性代谢物，其对靶标的抑制能力甚至强于药物原型。
对于化合物e产生的活性代谢产物，增加代谢酶蛋白浓度和化合物浓度进行代谢产物转化、分离、结构鉴定研究可进一步确证代谢产物，这也是发现新化合物的重要途径。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
阿片受体配体结合的活性筛选同时进行代谢稳定性筛选实验
实验步骤：
1.在cho细胞上表达阿片受体：具体步骤见文献报道：李玉蕾，等，人重组阿片样受体在cho细胞稳定表达系统的建立，军事医学科学院院刊，2009,33，(5)：409-485)；
2.细胞处理：细胞收集、裂解、膜蛋白提取：具体步骤为取出张满90％的细胞瓶，弃去培养液，用3mlpbs冲洗两次。每瓶培养瓶加入3ml胰蛋白酶溶液，消化8－10min后吹下细胞，收集入10ml离心管，1500rpm，4℃,离心8min。倒去上清液，加入pbs缓冲液孵育30min。冰浴下过针头(4号针头，0.45×13mm一次性注射器)5-10次。在离心管中加至2/3体积的lysisbuffer(约7ml)，高速离心(40,000×g，4℃，20min)。倒去上清液，加入50mmtris-hcl1ml，冰浴下过针头(4号针头，0.45×13mm一次性注射器)5次。在离心管中加至2/3体积的50mmtris-hcl(ph7.4)(约7ml)，高速离心(40,000×g，4℃，20min)。倒去上清液，加入50mmtris-hcl1ml，冰浴下过针头(4号针头，0.45×13mm一次性注射器)5次。在离心管中加至2/3体积的50mmtris-hcl(约7ml)，高速离心(40,000×g，4℃，20min)。倒去上清液，将提取的蛋白溶于1ml反应缓冲液(50mmtris-hcl，1.5mmcacl2,，5mmedta,5mmkcl，5mmmgcl2,120mmnacl.)(ph7.4)中。
3.反应系统中全细胞用量定为40万，以[3h]-二丙诺啡为标记配体，设置标记配体浓度为30nm；
4.待筛查化合物5个，zbh1#,2#,3#,4#,5#(自行设计合成的全新结构的5个候选化合物)，分别用pbs缓冲液稀释成系列浓度。实验分组，每个化合物分为两组，分别加入裂解细胞、[3h]-二丙诺啡(终浓度为30nm)、系列浓度化合物(终浓度为0,0.04,0.12,0.37,1.11,3.33,10,30μm)、人肝微粒体溶液(终浓度为0.5mg/ml)37℃预孵育5min后，其中一组加入nadph(1mm)启动反应，另一组不加入nadph，继续孵育60min后，均加4℃预冷的tris冲洗液(tris50mm，用hcl调ph值至7.4)4ml终止反应。经gf/c滤膜(whatman)滤过，多孔细胞收集器负压抽滤，再加4mltris冲洗液冲洗3次。滤膜80℃烤干后置于1ml闪烁液中过夜，ls6500型beckman液闪仪测量cpm(countperminute)。
绘制活性抑制曲线，结果表明，除了zbh2#、zbh3#化合物外，其他化合物均未发生竞争结合曲线明显漂移，稳定性较好。zbh3#与受体的竞争结合曲线在加入nadph后出现了右移(见图4)，zbh2#与受体的竞争结合曲线在加入nadph后出现了明显右移(见图3)，提示该化合物虽然具有受体结合活性，但代谢稳定性较差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。