本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745及其在制备红霉素衍生物中的应用。
背景技术：
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红霉素类抗生素是临床上用于治疗细菌感染的重要大环内酯类药物，包括红霉素a(erythromycina)、红霉素b(erythromycinb)、红霉素c(erythromycinc)和红霉素d(erythromycind)等[kibwageio,hoogmartensj,roetse,etal.antibacterialactivitiesoferythromycinsa,b,c,anddandsomeoftheirderivatives[j].antimicrobagentschemother,1985,28(5):630-633]。1952年，mcguiire等首次从糖多孢菌属放线菌saccharopolysporasp.中分离得到红霉素类抗生素[mcguirejm,bunchrl,andersonrc,etal.ilotycin,anewantibiotic[j].safrmedj,1952,82(41):565-566]。其中的红霉素a也是第一个被发现由放线菌生产的十四元大环内酯类抗生素。红霉素类抗生素对革兰氏阳性菌及部分革兰阴性菌有良好的抑菌活性，其抗菌谱与青霉素相似，临床上主要用于对青霉素耐药或过敏的金黄色葡萄球菌感染[liuf,wangc,zhangq,etal.establishmentofmultidrug-resistancecelllinec(6)/adrandreversalofdrug-resistance[j].chinmedj,2002,115(2):238-241]，及敏感菌所致的呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织、五官科感染。但随着呼吸道常见病原菌及其他病原微生物的出现，科研工作者筛选出了酸稳定性、半衰期及活性均优于红霉素的第二代红霉素，取代红霉素成为抗感染治疗的一线药物[kirstha.recentdevelopmentswithmacrolideantibiotics[j].expertopintherpat,2005,8(2):111-120]。随着抗菌药物的广泛使用，出现了大量耐药菌株[tensont,lovmarm,ehrenbergm.themechanismofactionofmacrolides,lincosamidesandstreptograminbrevealsthenascentpeptideexitpathintheribosome[j].jmolbiol,2003,330(5):1005-1014]。为解决耐药性的问题，研究者先后设计并合成了酮内酯(ketolide)、酰内酯(acylide)、双环内酯(bicyclolide)等红霉素类衍生物[glassfordi,leem,waghb,etal.desmethylmacrolides:synthesisandevaluationof4-desmethyltelithromycin[j].acsmedchemlett,2014,5(9):1021-1026][wuz,luy,luom,etal.synthesisandantibacterialactivityof3-o-carbamoylderivativesof6,11-di-o-methylerythromycina:anovelclassofacylides[j].eurjmedchem,2010,45(9):3636-3644][gaiy,tangd,xug,etal.synthesisof3,6-bicyclolides:anovelclassofmacrolideantibiotics[j].bioorgmedchemlett,2008,18(24):6315-6318]及其与其他抗菌活性化合物结构片段的杂合物等第三代红霉素。目前关于红霉素家族抗生素的研究除了红霉素结构的衍生化外，挖掘活性良好的红霉素类天然产物也是众多学者的研究热点之一。自1982年，thompson等克隆出红霉素抗性基因[thompsoncj,wardjm,hopwoodda.cloningofantibioticresistanceandnutritionalgenesinstreptomycetes[j].jbacteriol,1982,151(2):668-677]距今，国内外有众多关于红霉素的生物合成相关研究的报道，包括红霉素生物合成途径推导、关键酶的骨架及催化机制阐明及生产菌和工程菌的全基因组序列比较等[吴杰群，刘文，张嗣良.红霉素的生物合成与组合生物合成[j].有机化学,2012,32:1232-1240]。
技术实现要素：
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本发明的目的之一是提供一种能够产生红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745，该菌于2017年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，其保藏编号为：gdmccno.60232。
本发明人在对海洋放线菌活性次级代谢产物的筛选中，发现了采自中国南海沉积物中的糖多孢菌s.sp.scsio07745有丰富的次级代谢产物及良好抑菌活性。对该菌株进行发酵并运用活性追踪进行分离获得2个单体化合物。通过1h-nmr，13c-nmr及ms等波谱分析、理化数据对照和xrd单晶衍射分析，将其结构鉴定为红霉素类化合物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)，结构式见式(i)：
本发明的目的之二是提供海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745在制备红霉素衍生物sporeamicina(1)和/或erythromycinaenolether(2)中的应用。
本发明的目的之三是提供红霉素衍生物的制备方法，所述的红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)是从海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物中制备得到的。
按照本发明，优选所述的红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)是从海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物中制备得到的，具体包括以下步骤：
(a)制备海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏a，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏b；
(b)将浸膏a和浸膏b合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，用体积比100:0，98:2，96:4，95:5，90:10，8:2，5:5，0:100进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为5:5洗脱的馏分fr.7，经纯化获得化合物sporeamicina和erythromycinaenolether。
所述的纯化是将fr.7过中压反相柱层析，以流动相ch3cn/h2o0％～100％v/v梯度洗脱120min，流速10ml/min，每馏分100ml，顺序得到12个馏分fr.1～12，经hplc追踪检测，对fr.5进行凝胶柱层析，甲醇等度洗脱，以hplc追踪，将含有化合物sporeamicina的馏分和化合物erythromycinaenolether的馏分，用半制备高效液相色谱仪纯化获得化合物sporeamicina和化合物sporeamicina。
所述的制备海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物是通过以下方法制备：
将海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745接入种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：淀粉15g/l，鱼蛋白胨8g/l，细菌学蛋白胨5g/l，甘油6g/l，海盐30g/l，caco32g/l，kbr0.2g/l，余量为水，ph＝7.2～7.4。
本发明提供了一种能够产生红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745，利用该菌可以制备红霉素衍生物，从而为红霉素衍生物的生产制备提供了生物制备方法，具有广阔的应用前景。
本发明的糖多孢菌属(saccharopolysporasp.)scsio07745于2017年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，其保藏编号为：gdmccno.60232。
附图说明：
图1是海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的系统进化树，其中scsio07745代表海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745；
图2是海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745发酵生产红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的hplc图谱。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的分离与鉴定
本发明的海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745是从我国南海海域的沉积物样品中分离得到的。
该菌株的分类学特征是：
1、形态学特征：
菌落干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，易扩散，中间凸起，基内菌丝与气生菌丝易挑起，末期产孢子后，孢子易刮取。在isp4培养基上形成灰白色的气生菌丝和浅褐色的基质菌丝。
2、分子生物学分离特征：
提取上述分离的菌株的基因组dna，通过常规方法pcr扩增其16srdna序列，并测序分析，其16srdna序列如seqidno.1所示，构建基于16srdna序列的系统进化树(如图1所示)，显示菌株scsio07745与糖多孢菌属序列相似性度为100％，表明菌株scsio07745为海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)。
综上所述，鉴定菌株scsio07745属于海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)，命名为海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745，该菌于2017年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，其保藏编号为：gdmccno.60232。
实施例2：红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的分离鉴定
1、制备海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物：
(1)种子培养基和发酵培养基的配制：
a)种子培养基的配制：每升种子培养基中含有15g淀粉，8g鱼蛋白胨，5g细菌学蛋白胨，6g甘油，30g海盐，2gcaco3，0.2gkbr，余量为水，ph＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调ph值，配制1l种子培养基，然后平均分装于20个250ml锥形瓶中，每个装有50ml种子培养基，115℃灭菌30min，冷却后备用。
b)发酵培养基的配制：每升发酵培养基中含有15g淀粉，8g鱼蛋白胨，5g细菌学蛋白胨，6g甘油，30g海盐，2gcaco3，0.2gkbr，余量为水，ph＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调ph值，配制1l种子培养基，然后平均分装于5个1l锥形瓶中，115℃灭菌30min，冷却后备用。
(2)种子的培养：
将活化的海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745(保藏编号为：gdmccno.60232)接入到装有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃、200rpm的摇床上培养24h，得到种子培养液。
(3)规模发酵培养：
将上述锥形瓶中的50ml种子培养液转接到装有200ml发酵培养基的1l锥形瓶中，于28℃、200r/min的摇床上培养7天，获得海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物。
2、海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745所产红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的分离
(1)发酵培养物的萃取
将海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物进行离心分离(3800～4000r/min，10～15min)使发酵上清液与菌丝体分开；发酵上清液使用丁酮进行等体积萃取3次，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏a；菌丝体使用丙酮(2l)浸泡萃取，超声处理得到丙酮浸提液，丙酮浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏b。
(2)红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)的提取
经hplc分析，浸膏a和浸膏b的成分类似，将浸膏a和浸膏b合并，经正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100：0、95：5、92：8、90：10、8：2、7：3、1：1、0：100进行梯度洗脱，100％氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为fr.1，氯仿-甲醇体积比为95:5梯度下洗脱下来的馏分记为fr2，氯仿-甲醇体积比为92:8梯度下洗脱下来的馏分记为fr3，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分记为fr.4，氯仿-甲醇体积比为8:2梯度下洗脱下来的馏分记为fr.5，氯仿-甲醇体积比为7:3梯度下洗脱下来的馏分记为fr.6，氯仿-甲醇体积比为1:1梯度下洗脱下来的馏分记为fr.7，100％甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为fr.8。
对上述馏分fr.1～8进行高效液相分析，发现fr.7馏分中含有红霉素衍生物sporeamicina(1)和erythromycinaenolether(2)，fr.7馏分经中压反相柱层析(流动相ch3cn/h2o0％～100％v/v梯度洗脱120min，流速10ml/min)，每馏分100ml，顺序得到12个馏分fr.1～12。经hplc追踪检测，对fr.5进行凝胶柱层析，甲醇等度洗脱，得到20个馏分fr.1～20。hplc追踪检测后，分别合并fr.4～6(含化合物sporeamicina)及fr.9～13(含化合物erythromycinaenolether)。用半制备高效液相色谱仪(ymc-packods-acolumn，流动相ch3cn/h2o40％～70％v/v梯度洗脱30min，流速2.5ml/min)纯化fr.4～6，得到化合物1(sporeamicina，保留时间16min)。fr.9～13用半制备高效液相色谱仪(ymc-packods-acolumn，流动相ch3cn/h2o50％～80％v/v梯度洗脱30min，流速2.5ml/min)进一步纯化，得到化合物2(erythromycinaenolether，保留时间20min)。
(3)红霉素衍生物sporeamicina和erythromycinaenolether的鉴定
通过结构分析，对本发明的从海洋糖多孢菌(saccharopolysporasp.)scsio07745的发酵培养物中制备的化合物
鉴定结果如下：
化合物1：为白色粉末状固体，(+)hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z：736.4254[m+na]+，推断分子式为c37h63no12。在1h-nmr(700mhz，methanol-d4)谱中，δh3.24(3h，s)提示可能为1个连有氧原子的甲基氢信号。通过13c-nmr(175mhz，methanol-d4)谱与dept-135(175mhz，methanol-d4)相结合，一共给出37个碳信号。其中含7个季碳信号δc：207.2，195.8，178.2，109.9，88.4，75.8，74.4；4个亚甲基信号δc：43.0，35.9，31.3，22.9。经与文献[morishitaa,murofushis,ishizawak,etal.isolationandcharacterizationofsporeamicinc[j].jantibioti(tokyo),1992,45(6):1011-1015]对比，确定化合物1的结构为sporeaminea，其结构如式(i)中化合物1所示。通过在甲醇-dmso混合溶液中培养，获得了化合物1的单晶。通过xrd单晶衍射确认了化合物1的结构，晶体数据已上传至剑桥晶体数据库中心(thecambridgecrystallographicdatacentre，ccdc)：ccdc1838257。
化合物1的波谱数据如下：1h-nmr(700mhz，methanol-d4)δh：5.01(1h，dd，j＝10.1，3.2hz，h-13)，4.72(1h，d，j＝4.7hz，h-1”)，4.62(1h，d，j＝5.8hz，h-1’)，4.05(1h，dq，j＝12.6，6.2hz，h-5”)，3.98(1h，dd，j＝5.1，3.1hz，h-3)，3.77(1h，dd，j＝8.9，5.9hz，h-5’)，3.57(1h，d，j＝5.4，h-5)，3.38(1h，m，h-2’)，3.35(1h，m，h-3’)，3.24(3h，s，h-8”)，2.97(2h，dd，j＝18.1，7.9hz，h-4”)，2.95(2h，dd，j＝18.1，7.9hz，h-4”)，2.75(6h，s，n(ch3)2)，2.49(1h，m，h-2)，2.32(1h，d，j＝15.2，h-2”b)，2.13(1h，dd，j＝14.9，6.2hz，h-7b)，1.95(1h，m，h-4’b)，1.81(2h，m，h-14b)，1.80(2h，m，h-4)，1.73(2h，m，h-7a，h-14a)，1.65(3h，s，h-20)，1.48(2h，m，h-2”a)，1.45(2h，m，h-4’a)，1.25(6h，m，h-19，h-21)，1.21(3h，d，j＝6.1，h-6’)，1.19(3h，m，h-18)，1.17(3h，m，h-6”)，1.15(3h，m，h-7”)，1.08(3h，d，j＝7.2，h-16)，0.99(3h，d，j＝7.4，h-17)，0.87(3h，t，j＝7.5，h-15)；13c-nmr(175mhz，methanol-d4)δc：207.2(c-11)，195.8(c-9)，178.2(c-1)，109.9(c-10)，102.6(c-1’)，97.1(c-1”)，88.4(c-12)，83.3(c-5)，79.2(c-3)，78.9(c-4”)，78.8(c-13)，75.8(c-6)，74.4(c-3”)，70.7(c-2’)，68.8(c-5’)，66.6(c-5”)，66.4(c-3’)，49.9(c-8”)，46.1(c-2)，43.4(c-4)，43.0(c-7)，39.9(c-7’)，39.9(c-8’)，35.9(c-2”)，33.3(c-8)，31.3(c-4’)，27.0(c-18)，22.9(c-14)，21.6(c-7”)，21.3(c-19)，21.2(c-6’)，20.2(c-21)，18.7(c-6”)，14.5(c-16)，11.2(c-17)，11.1(c-15)，6.3(c-20)；(+)hr-esi-msm/z736.4254[m+na]+。
化合物2：为白色粉末状固体，(+)hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z716.4595[m+h]+，推断分子式为c37h65no12。通过与化合物1核磁数据对比，其主要差异在于大环内酯母核上c-8(δc102.2)，c-9(δc153.5)，c-10(δc32.3)，c-11(δc71.9)及与其相连的两个甲基碳c-20(δc9.2)，c-21(δc17.1)。同时经与文献[larteypa,nellanshn,faghihr,etal.synthesisof4"-deoxymotilides:identificationofapotentandorallyactiveprokineticdrugcandidate[j].jmedchem,1995,38(10):1793-1798]对比，确定化合物2的结构为红霉素衍生物erythromycinaenolether，其结构如式(i)中化合物2所示。
化合物2的波谱数据如下：1h-nmr(700mhz，methanol-d4)δh：5.02-4.97(2h，m，h-13，h-1”)，4.53(1h，d，j＝7.3hz，h-1’)，4.21(1h，m，h-5”)，4.03(1h，m，h-4”)，3.91(1h，d，j＝7.2hz，h-5)，3.79(1h，m，h-5’)，3.41(1h，m，h-2’)，3.38(3h，s，h-8”)，3.31(1h，m，h-11)，3.07(1h，d，j＝9.5，h-3)，2.88(1h，m，h-3’)，2.75(1h，m，h-2)，2.68(1h，m，h-2”b)，2.66(1h，m，h-7b)，2.48(6h，s，n(ch3)2)，2.47(1h，m，h-10)，1.93(1h，m，h-4)，1.9(1h，m，h-7a)，1.82(1h，m，h-4’b)，1.6(3h，m，h-17)，1.59(1h，m，h-2”a)，1.35(3h，m，h-18)，1.29(1h，m，h-4’a)，1.20-1.33(11h，m，h-14，19，6’，7”)，1.16(3h，m，h-16)，1.1(3h，d，j＝7.8，h-20)，1.08(6h，m，h-21，h-6”)，0.88(3h，t，j＝7.5，h-15)；13c-nmr(175mhz，methanol-d4)δc：179.1(c-1)，153.5(c-9)，104.0(c-1’)，102.2(c-8)，96.4(c-1”)，86.6(c-12)，81.6(c-5)，79.1(c-3)，78.9(c-13)，78.3(c-4”)，76.5(c-6)，74.4(c-3”)，71.9(c-11)，71.0(c-2’)，68.8(c-5’)，66.6(c-5”)，66.0(c-3’)，49.9(c-8”)，45.9(c-2)，44.7(c-4)，43.4(c-7)，40.3(c-7’)，40.3(c-8’)，35.7(c-2”)，32.3(c-10)，31.6(c-4’)，26.8(c-18)，22.0(c-14)，21.7(c-7”)，21.5(c-19)，18.8(c-6’)，17.1(c-21)，16.0(c-6”)，13.9(c-16)，12.1(c-17)，11.1(c-15)，9.2(c-20)；hr-esi-ms(+)m/z716.4595[m+h]+。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>一种海洋糖多孢红霉菌及其在制备红霉素衍生物中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1483
<212>dna
<213>糖多孢菌scsio07745(saccharopolysporasp.scsio07745)
<400>1
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