本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种靶向作用syntenin蛋白的多肽及其二聚体和应用。
背景技术：
：多配体蛋白聚糖结合蛋白syntenin是在原核生物及真核生物中广泛存在的一类胞内衔接蛋白(adaptorproteins)。研究发现syntenin蛋白在多种高侵袭性恶性肿瘤中高度表达，并且其表达随肿瘤转移的进展而上调。syntenin由n端结构域(n-terminaldomain，ntd)、两个串联的pdz结构域(postsynapticdensityprotein，disclargeandzonulaoccludens，pdz)和c端结构域(c-terminaldomain，ctd)组成。syntenin蛋白的pdz结构域可与不同膜受体c端的pdz结合基序(pdzbindingmotif，pbm)特异性结合，pdz结构域结合受体的多样性导致了syntenin功能的多样性。在肿瘤细胞发生发展过程中，pdz结构域与一系列配体结合并相互作用，激活下游erk1/2mapk信号通路的磷酸化，进而发生一系列信号传导，最终上调基质金属蛋白酶mmp-2的活性，降解细胞外基质，促进肿瘤细胞迁移进入周围的间质中。申请号为200580028969.9的专利文献公开了一种可有效抑制pdz结构域相互作用的小分子，该化合物在超表达dvi的癌细胞中产生编程性细胞死亡。基于syntenin蛋白是一个有潜力的抑制肿瘤侵袭的药物靶点，kegelman等开发了一种与syntenin非共价结合的小分子抑制剂类化合物，在抑制胶质母细胞瘤侵袭上发挥了良好的效果(kegelman，t.p.eta1.inhibitionofradiation-inducedglioblastomainvasionbygeneticandpharmacologicaltargetingofmda-9/syntenin.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2017，114，(2)，370-375.)。但是由于syntenin蛋白串联pdz结构域含有一个较大的疏水口袋结构，小分子化合物由于分子大小的局限性，与蛋白的亲和力较低，只有20um，因此实验中分子浓度高达50um，否则便难以发挥抑制效果，同时小分子药物本身存在代谢快、毒性大等不利因素。在自然状态下，pdz结构域的疏水口袋会与其相互作用蛋白的c端多肽结合，进而形成复杂的蛋白复合物并发挥功能。随着pdz结构域在多种蛋白-蛋白相互作用中的深入研究，提供一种与pdz结构域具有高亲和力的抑制剂，进而达到抑制syntenin高表达的恶性肿瘤转移侵袭的目的，是本领域技术人员需要解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种靶向作用syntenin蛋白的具有高亲和力的抑制剂，通过结合syntenin蛋白中串联pdz结构域来达到抑制癌细胞迁移、增殖、侵袭的目的，以解决小分子抑制剂亲和力不高，有效作用浓度高的缺点。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明从syntenin蛋白pdz结构域与天然多肽配体结合的晶体结构(pdbid：1w9o)出发，筛选出系列高亲和力的天然多肽单体。研究发现天然多肽配体的倒数第二、三个氨基酸与pdz疏水口袋中的组氨酸his208，缬氨酸val222和苯丙氨酸phe213有较强的相互作用，因此将多肽配体的倒数第二、三个氨基酸替换为带有强疏水残基的非天然氨基酸φ：3-(2-萘基)-l-丙氨酸(英文为3-(2-naphthyl)-l-alanine)，修饰后的多肽单体与串联pdz结构域的亲和力进一步增强。因此，本发明提供了一种靶向作用syntenin蛋白的多肽，所述多肽的氨基酸序列为cys-asp-lys-φ-φ-val，其中φ为3-(2-萘基)-l-丙氨酸。本发明还提供了所述的靶向作用syntenin蛋白的多肽在制备syntenin蛋白活性抑制剂中的应用。为完善所述多肽作为治疗药物的作用能力，在所述多肽上修饰有渗透性增强部分，如穿膜肽r9、tat、map、mpg等，使其具备跨膜渗透性，作为优选，所述多肽n端修饰有富精氨酸多肽r9。本发明利用交联剂将上述多肽二聚化，研究发现，相比于多肽单体，二聚体多肽与串联pdz结构域的亲和力大大增强。因此，本发明提供了一种所述的靶向作用syntenin蛋白的多肽进行二聚化形成的二聚体多肽。所述交联剂为1，11-双马来酰亚胺基-3，6，9-三氧代十一烷(1，11-bis(maleimido)triethyleneglycol)或1，8-二(马来酰亚胺基)-3，6-二氧杂辛烷(1，8-bis(maleimido)diethyleneglycol)，两者的区别在于长度不同。作为优选，根据syntenin蛋白晶体空间结构，选用1，11-双马来酰亚胺基-3，6，9-三氧代十一烷作为交联剂。制得的二聚体多肽的结构式如式(i)所示，其中φ为3-(2-萘基)-l-丙氨酸。作为优选，所述二聚体多肽的肽链上修饰有穿膜肽。通过在二聚体多肽上修饰有渗透性增强部分，使其具备跨膜渗透性，完善其作为治疗药物的作用能力。作为优选，所述二聚体多肽的其中一个半胱氨酸残基上修饰有富精氨酸多肽。所述富精氨酸多肽与所述二聚体多肽上半胱氨酸残基的氨基末端直接或通过间隔物进行连接。所述的富精氨酸多肽由9个l型精氨酸残基组成。所述二聚体多肽的结构式如式(ii)所示，其中φ为3-(2-萘基)-l-丙氨酸。本发明的另一个目的是提供所述二聚体多肽的应用。上述的修饰后的二聚体多肽与syntenin蛋白串联pdz结构域的亲和力高达210nm，可以作为syntenin蛋白串联pdz结构域与其他蛋白相互作用的抑制剂，因此，本发明提供了所述的二聚体多肽在制备syntenin蛋白活性抑制剂中的应用。本发明研究表明，所述的二聚体多肽结合syntenin蛋白串联pdz结构域后，有效抑制syntenin下游erk1/2mapk信号通路的磷酸化，进而降低了基质金属蛋白酶mmp-2的活性，因此，本发明提供了所述的二聚体多肽在制备抑制肿瘤细胞中基质金属蛋白酶mmp-2活性上调的药物中的应用。本发明研究表明，所述的二聚体多肽与syntenin有极高的亲和性，在10um浓度下即能有效抑制syntenin高表达的多种癌细胞的迁移、增殖、侵袭，同时不产生其他毒副作用。因此，本发明提供了所述的二聚体多肽在制备抑制syntenin蛋白高表达的肿瘤细胞迁移、增殖、侵袭的药物中的应用。作为优选，所述的肿瘤细胞为人宫颈癌细胞系、乳腺导管癌细胞系。本发明还提供了一种治疗syntenin蛋白高表达的恶性肿瘤转移侵袭的药物组合物，包括有效剂量的所述的二聚体多肽(结构式如式ii所示)和药学上可接受的载体。所述有效量是指使被治疗的对象症状好转的充分剂量，所述好转是指在治疗中降低或减轻患病状态所带来的负面效应。活性治疗成分通常与药用载体共同使用，药用载体可根据现有的多肽类药物常用的剂型进行合理选择。本发明具备的有益效果：本发明提供的靶向作用syntenin蛋白的多肽是通过对筛选得到的天然多肽配体进行氨基酸优化得到，显著提高了其与syntenin蛋白串联pdz结构域的亲和力。将上述多肽进行二聚化得到的二聚体多肽，与串联pdz结构域的亲和力高达210nm，为迄今报道的首个针对syntenin蛋白的多肽抑制剂。本发明提供的二聚体多肽与syntenin有极高的亲和性，在10um浓度下即能有效抑制syntenin高表达的多种癌细胞的迁移、增殖、侵袭，同时不产生其他毒副作用，为治疗syntenin高表达的恶性肿瘤转移侵袭的药物开发提供设计思路。附图说明图1为单体多肽与synteninpdz1的结合力表征，其中(a)为p1，(b)为p2，(c)为p3，(d)为p4。图2为单体多肽与synteninpdz2的结合力表征，其中(a)为p1，(b)为p2，(c)为p3，(d)为p4。图3为二聚体多肽结构式示意图。图4为二聚体多肽与syntenin串联pdz结构域的亲和力表征，其中(a)为p2-2，(b)为p2-3，(c)为p2-4，(d)为p3-3，(e)为p3-4，(f)为p4-4。图5为单体多肽与syntenin串联pdz结构域的亲和力表征，其中(a)为p2，(b)为p3，(c)为p4。图6为优化的单体多肽与串联pdz结构域的亲和力表征，其中(a)为p5，(b)为p6，(c)为p7，(d)为p8，(e)为p9，(f)为p10，(g)为p11，(h)为p12，(i)为p13。图7为优化后的二聚体多肽结构(a)及其与串联pdz结构域的亲和力表征(b)-(d)和p13-13与单体pdz1、pdz2的亲和力表征(e)-(f)。图8为不同癌细胞的syntenin表达情况，其中(a)为mrna水平检测结果，(b)为westernblot检测结果。图9为hela细胞系的伤痕愈合实验，其中(a)为实物图，(b)为数据分析图。图10为二聚体多肽抑制erk1/2mapk信号通路的磷酸化检测结果，其中(a)为weatemblot检测erk表达情况，(b)为数据分析图。图11为二聚体多肽降低基质金属蛋白酶mmp-2的活性检测结果，其中(a)为人宫颈癌细胞系hela细胞系，(b)为乳腺导管癌细胞系mda-mb-435，(c)为乳腺腺癌细胞系mda-mb-231。图12为二聚体多肽抑制syntenin高表达癌细胞的增殖检测结果，其中(a)为人宫颈癌细胞系hela细胞系，(b)为乳腺导管癌细胞系mda-mb-435，(c)为乳腺腺癌细胞系mda-mb-231。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。一、多肽的合成与亲和力表征从文献中选取如下四条多肽序列：rvaffeel(merlin蛋白的多肽表位)，tnefya(syndecan蛋白的多肽表位)，dkeyyv(neurexin蛋白的多肽表位)，ledsvf(interleukin-5receptorα蛋白的多肽表位)。为了便于后续表征，在n端加上fam荧光基团，并以gs氨基酸作为荧光基团和功能氨基酸区域的间隔。1、单体多肽的合成1)采用fmoc化学固相多肽合成，使用fmoc-wang树脂，用5倍过量的fmoc保护的氨基酸和缩合试剂(hbtu/hobt)合成多肽。2)在靠近多肽n端的地方添加半胱氨酸c，提供巯基(hs-)反应基团。3)多肽n端fmoc脱保护后，用edc/hobt缩合剂连接fam荧光基团。4)用95％tfa将多肽从树脂上切除，用冰乙醚沉淀，得到的初步多肽用hplc分离纯化。2、二聚体多肽的合成利用巯基(hs-)可与马来酰亚胺高特异性反应的特点，将两条多肽单体分别与马来酰亚胺-peg3链接物反应，得到多肽二聚体。3、多肽表征经hplc分离纯化的多肽用maldi-tofms来检测证实分子量，用hplc来验证纯度。4、多肽与syntenin蛋白pdz串联结构域的体外亲和力表征(1)构建pgex-syntenintandempdz、pgex-synteninpdz1、pgex-synteninpdz2原核表达质粒按照syntenintandempdzcdna序列设计syntenintandempdz原核表达基因序列，并由相关基因合成公司合成。用酶切的方法得到syntenintandempdz片段，用pcr方法得到synteninpdz1和synteninpdz2片段，并用t4连接酶(takara)连接原核表达质粒pgex-6p-1中，并测序验证。(2)e.coli原核表达并纯化蛋白syntenintandempdz、synteninpdz1、pgexpdz2经验证正确的质粒转化于bl-21感受态细胞中，挑克隆验证正确后，加在灭菌的5mllb培养基中37℃摇过夜。之后取4ml加于400mllb中37℃摇到od600约04-0.6，加iptg诱导，然后16℃摇18小时。之后离心机去掉菌液上清，菌体用超声破碎。利用gst标签纯化蛋白，得到蛋白syntenintandempdz、synteninpdz1、pgexpdz2并用sds-page验证。(3)多肽与syntenin蛋白pdz结构域的体外亲和力表征将冻干多肽溶于蛋白储存缓冲液中，然后将多肽、蛋白溶液用0.1umpvdm膜过滤，去除可能存在的微小颗粒。然后用荧光分光光度计检测多肽溶液的荧光偏振值，之后每次加入一定量蛋白，孵育一定时间后，检测多肽-蛋白混合液的荧光偏振值，将一系列不同浓度蛋白对应的荧光偏振值做图，可拟合出多肽与蛋白的亲和力。a.单体多肽(表1)与syntenin蛋白pdz结构域的体外亲和力表征结果如图1、图2所示，并总结在表2中。表1单体多肽的序列单体多肽序列p1famcgsygsrvaffeelp2famgcgstnefyap3famgcgsdkeyyvp4famgcygsledsvf表2单体多肽与synteninpdz1和pdz2结构域的结合力亲和力kd(μm)p1p2p3p4synteninpdz1282±2994±681±758±4synteninpdz2531±11468±433±260±5实验发现天然单体多肽配体与synteninpdz结构域的亲和力中等偏弱，与文献报道相符。由于p1与synteninpdz的结合力比p2、p3、p4弱一个数量级，因此后续设计合成以用p2、p3、p4的功能序列为基础开展。b.利用马来酰亚胺-peg3链接物将单体多肽p2、p3、p4二聚化，二聚体多肽结构见图3。荧光偏振实验表征了二聚体多肽与syntenin串联pdz结构域的亲和力，见图4，并总结在表3中。表3二聚体多肽与syntenin串联pdz结构域的结合力与单体相比(图5)，二聚体多肽与syntenin串联pdz结构域的亲和力大大提高了。c.多肽单体序列的优化由晶体结构分析，单体多肽配体c端倒数第二、三个氨基酸与pdz疏水口袋中的组氨酸his208、缬氨酸val222和苯丙氨酸phe213有较强的相互作用。前步骤实验中，p3多肽单体与串联pdz结构域的亲和力最强。因此，我们以p3多肽序列为基础，将c端倒数第二、三个氨基酸(酪氨酸y)替换为带有不同疏水残基的氨基酸：色氨酸w，苯丙氨酸f，以及非天然氨基酸φ(3-(2-萘基)-l-丙氨酸(英文为3-(2-naphthyl)-l-alanine)naphthyl-alanine)，合成得到p5-p13，序列见表4。亲和力表征如图6所示，并总结在表4中。表4优化的单体多肽序列及其与串联pdz结构域的亲和力总结替换为苯丙氨酸f后，单体多肽(p8-p10)亲和力与原多肽p3相差不大，推测是由于f疏水残基苯基与酪氨酸y的羟苯基大小相似；替换为色氨酸w后，单体多肽(p5-p7)亲和力比原多肽p3稍高，推测是由于w疏水残基吲哚基比y的羟苯基大；替换为非天然氨基酸φ后，单体多肽(p11-p13)亲和力比原多肽p3明显提高，推测是由于φ疏水残基萘基具有最强的疏水性，因此与pdz结构域的疏水口袋有很强的相互作用。d.优化后的多肽二聚化体与syntenin串联pdz结构域具有极高的亲和力前述可知将单体多肽二聚化能大大提高多肽与pdz串联结构域的亲和力，因此我们将优化后的具有较高亲和力的单体多肽p11、p12、p13二聚化，序列结构见图7(a)。由图7(b)-(f)可知二聚化显著提高了多肽与串联pdz结构域之间的亲和力，并总结在表5，其中p13-13亲和力高达210nm，比原多肽p3亲和力提高了160倍。表5p13-13亲和力表征由此，经过一系列设计与合成，我们成功得到了高亲和力的二聚体多肽p13-13。二、在syntenin高表达的不同癌细胞系检测多肽抗肿瘤效果1、不同细胞系表达syntenin的情况trizol提取细胞中总rna，并用逆转录法进行特异性扩增syntenin蛋白，并用qpcr定量mrna表达量。将人宫颈癌细胞系hela、乳腺导管癌细胞系mda-mb-435、乳腺腺癌细胞系mda-mb-231铺于10mm培养皿。长满后pbs洗涤并用裂解液在冰上裂解，取裂解上清液，用westernblot实验检测syntenin蛋白表达情况。若表达，则蛋白可被特异性syntenin抗体识别，并最终呈现出条带。由mrna表达和蛋白表达(见图8)可知，hela和mda-mb-435高表达syntenin，而乳腺腺癌细胞系mda-mb-231几乎不表达syntenin。2、二聚体多肽对癌细胞迁移的影响检测伤痕愈合实验scratchwoundmigrationassays：将hela细胞铺于24孔板，每孔1×105细胞，分别加穿膜肽r9修饰后的二聚体多肽p13-13(r9-dimer)、穿膜肽r9修饰后的多肽p13(r9-mono)和对照单体多肽r9，浓度为10μm，作用20min。用10ul枪头在孔正中间位置划一伤痕，分别在0h和24h在显微下观察伤痕宽度，计算细胞迁移长度，结果如图9所示。上述结果均表明，10um的13-13二聚体多肽可以有效抑制syntenin高表达癌细胞的迁移。3、二聚体多肽对于syntenin下游信号通路的影响。erk1/2mapk信号通路的磷酸化：将hela铺于10mm培养皿，分别加穿膜肽r9修饰后的二聚体多肽p13-13(r9-dimer)、穿膜肽r9修饰后的多肽p13(r9-mono)和对照单体多肽r9，浓度为10μm，作用20min。细胞过夜培养后裂解，用westernblot实验验证磷酸化的erk表达情况，结果如图10所示。基质金属蛋白酶mmp-2的活性：将hela铺于12孔板，分别加穿膜肽r9修饰后的二聚体多肽p13-13(r9-dimer)、穿膜肽r9修饰后的多肽p13(r9-mono)和对照单体多肽r9，浓度为10μm，作用20min。细胞孵育48h后取上清，用基质金属蛋白酶mmp-2酶联免疫吸附法试剂盒检测mmp-2的活性，结果如图11所示。上述结果表明，二聚体多肽有效抑制syntenin下游erk1/2mapk信号通路的磷酸化，进而降低了基质金属蛋白酶mmp-2的活性。4、二聚体多肽对于癌细胞增殖的影响如图12所示，二聚体多肽有效抑制syntenin高表达癌细胞的增殖。序列表<110>上海市第一妇婴保健院<120>一种靶向作用syntenin蛋白的多肽及其二聚体和应用<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(5)..(5)<223>the'xaa'atlocation5standsfor3-(2-naphthyl)-l-alanine<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>the'xaa'atlocation5standsfor3-(2-naphthyl)-l-alanine<220><221>unsure<222>(5)..(5)<223>the'xaa'atlocation5standsforgln,arg,pro,orleu.<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>the'xaa'atlocation6standsforgln,arg,pro,orleu.<400>1cysasplysgluxaaxaaval15<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cysglysertyrglyserargvalalaphepheglugluleu1510<210>3<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3glycysglyserthrasngluphetyrala1510<210>4<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4glycysglyserasplysglutyrtyrval1510<210>5<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5glycystyrglyserleugluaspservalphe1510<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cysasplysglutyrtrpval15<210>7<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cysasplysglutrptrpval15<210>8<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cysasplysglutrptyrval15<210>9<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cysasplysgluphepheval15<210>10<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cysasplysgluphetrpval15<210>11<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cysasplysglutyrpheval15<210>12<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>the'xaa'atlocation5standsfor3-(2-naphthyl)-l-alanine<220><221>unsure<222>(6)..(6)<223>the'xaa'atlocation6standsforgln,arg,pro,orleu.<400>12cysasplysglutyrxaaval15<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220>当前第1页12