本发明涉及一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。
背景技术：
混源萜用于描述通过异戊烯基途径杂合其他生物合成途径形成的天然产物，具有复杂多变的结构多样性，进而显示了多种多样的生物活性。部分该类化合物已作为治疗药物用于临床，如抗肿瘤药物长春花碱、免疫抑制剂霉酚酸酯、乙酰胆碱酯酶抑制剂土震素b等。terretonins是一类以3,5-demethylorsellinicacid（dmoa）和arnesylpyrophosphate（fpp）为合成前体的真菌来源混源萜类化合物，主要从曲霉菌发酵产物中分离得到（guoetal.,moleculargeneticcharacterizationofaclusterina.terreusforbiosynthesisofthemeroterpenoidterretonin.orglett.2012,14:5684–5687）。截止目前，terretonin（springer,terretonin,atoxiccompoundfromaspergillusterreus.jorgchem,1979,44:4852–4854）及其结构类似物terretoninsa–d（lietal.,sesterterpenoids,terretoninsa-d,andanalkaloid,asterrelenin,fromaspergillusterreus.jnatprod,2005,68:1243–1246）、h–k（matsudaetal.,uncoveringtheunusuald-ringconstructioninterretoninbiosynthesisbycollaborationofamultifunctionalcytochromep450andauniqueisomerase.jamchemsoc,2015,137:3393–3401）和m（shaabanetal.terretoninm:anewmeroterpenoidfromthethermophilicaspergillusterreustm8andrevisionoftheabsoluteconfigurationofpenisimplicins.natprodres,2017,doi:10.1080/14786419.2017.1419230）均分离自土曲霉aspergillusterreus发酵物中，分子中存在式i中显示的一个独特的骈四环结构母核，且天然产物的绝对构型一致，其中14-h为β取向。近期发现的两个结构类似物，“terretoninh”和“terretonini”分离自海洋来源焦曲霉aspergillusustus（oleinikovaetal.,twonewsesterterpenoids,terretoninshandi,fromthemarine-derivedfungusaspergillusustus.phytochemlett,2016,17:135–139），与上述化合物相比其结构特征是c-14位的绝对构型发生转变，即14-h为α取向。terretoninse和f作为线粒体呼吸链抑制剂分离自海洋来源真菌aspergillusinsuetus发酵物中（lopez-gresaetal.,terretoninseandf,inhibitorsofthemitochondrialrespiratorychainfromthemarine-derivedfungusaspergillusinsuetus.jnatprod,2009,72:1348–1351），其与terretoninl属于一类特殊的terretonins亚型。
中国专利cn201510244085.2报道了一种α-吡喃酮混源萜及其制备方法和应用，应用于制备抗流感病毒药物。cn107362077a仅仅一次性提到了马尾藻属植物富含甘油糖脂、植物甾醇、混源萜类、褐藻多酚、含氮化合物等成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗病毒等多种生物活性。因此，迄今关于terretonins活性研究报道非常少，并无报道terretonin及其类似物具有抗炎活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。该混源萜类化合物及其结构类似物具有抗炎活性，为开发新型抗炎药物提供先导化合物，用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病。
本发明提供的混源萜类（terretonins）化合物如下述式i结构所示：
i
本发明涉及的式i化合物，区别于已知化合物terretonind，其14-h为α取向。
本发明的还涉及式i化合物、与式i化合物的结构类似物terretonin，即化合物ii、terretonina，即化合物iii、terretonind，即化合物iv单独或以组合物形式（如药学上可接受的辅助剂等）在制备抗炎药物中的用途。
iiiiiiv
本发明提供了的土曲霉（aspergillusterreus）ml-44，其保藏编号为cgmccno.15664，保藏日期为2018年04月17日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株是从太平洋牡蛎的消化道样品中分离，经分类学研究鉴定为土曲霉（aspergillusterreus）。
本发明提供的式i化合物及其结构类似物的制备方法包括如下步骤：
将上述的土曲霉进行发酵培养，获得含有式i化合物及其结构类似物的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到所述化合物。也可以使用曲霉属的其它能够产生式i化合物的生产菌进行发酵培养。
所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如萃取、柱层析、高效液相制备等。
本发明提供的式i化合物的具体制备方法包括如下步骤：
1)将上述的土曲霉进行大米固体发酵培养，获得发酵物；
2)将所得发酵物用50%-90%（v/v）的丙酮水溶液超声浸提、过滤，滤液经减压浓缩至不含丙酮，残余混悬液用乙酸乙酯萃取，得到发酵物的乙酸乙酯萃取物；
3)将步骤2)得到乙酸乙酯萃取物减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏；
4)将乙酸乙酯总浸膏依次用硅胶柱层析，石油醚‒二氯甲烷‒甲醇梯度洗脱、sephadexlh-20柱层析，甲醇洗脱，和ods柱层析，水→100%甲醇梯度洗脱，分离，得到含有所述化合物的柱层析组分；
5)将含有所述化合物的柱层析组分经hplc分离。
步骤2)中的丙酮水溶液为70%-90%（v/v），优选为75%-85%（v/v），更优选为80%（v/v）。
本发明采用griess法，对式i化合物及其上述结构类似物对lps诱导raw264.7细胞no释放的抑制作用进行了测试。经实验证实，式i化合物及上述结构类似物可显著抑制lps诱导raw264.7细胞no的释放，因而具有抗炎作用。
本发明的还提供了土曲霉ml-44的发酵物的提取物，所述提取物含有本发明的式i化合物及其结构类似物。具体地，所述提取物为土曲霉ml-44发酵物的乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯总浸膏、或者层析组分。所述提取物可以参照上面本发明的化合物的制备方法的相应步骤制得。具体地，所述提取物可以通过萃取、柱层析、高效液相制备得到。
本发明还提供了土曲霉ml-44发酵物的提取物在制备抗炎药物中的用途。
总之，本发明提供了含有所述的具有式i所示的结构及其上述结构类似物（ii-iv）或其药学上可接受的盐的药物，所述药物包括药学上可接受的辅助剂；所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂等。
所述的混源萜类化合物或其药学上可接受的盐单独或以组合物形式在制备抗炎的的药物的应用。
本发明提供一种抗炎的药物，包括有效量的所述的混源萜类化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
本发明的还提供上述土曲霉ml-44在制备本发明的式i化合物中或者发酵物的提取物中的用途。
本发明的式i化合物及其上述结构类似物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗炎药物，用于炎症性疾病的治疗。
本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01-100mg/kg体重/天。
本发明提供了式i化合物及其上述结构类似物（ii-iv）的细胞活性测试，本发明具有抑制lps诱导raw264.7细胞no释放的作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，表明具有抗炎活性，因此可用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病，为开发新型抗炎药物提供先导化合物。
附图说明
图1为化合物i的x射线单晶衍射结构。
图2为化合物i的hr-esi-ms谱图。
图3为化合物i的1hnmr谱图。
图4为化合物i的13cnmr谱图。
图5为化合物i的dept谱图。
图6为化合物i的1h-1hcosy谱图。
图7为化合物i的hmqc谱图。
图8为化合物i的hmbc谱图。
图9为化合物i的noesy谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在以下实施例中，称为化合物i的为式i所示化合物，系本发明首次发现的新化合物；称为化合物ii的是已知化合物terretonin；称为化合物iii的是已知化合物terretonina；称为化合物iv的是已知化合物terretonind。
阿拉伯数字表示相应标位。
i
在下面实施例的结构研究中，比旋光度用日本jascop-1020型旋光仪测定。esi-ms和hr-esi-ms分别用美国thermoscientific公司lcqfleet液质联用仪和agilent公司lct6200seriestof/6500型质谱仪测定，nmr谱图用瑞士bruke公司avanceiii500型超导核磁共振仪（500mhz1h-nmr，125mhz13c-nmr）测定。
实施例1：微生物发酵培养与化合物的制备
1.发酵培养与发酵物的提取处理
1)生产菌株
本实施例中用于发酵生产化合物i-iv的产生菌是分离自太平洋牡蛎消化道的土曲霉菌（aspergillusterreus）ml-44株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），保藏编号为cgmccno.15664。
2)发酵培养
按微生物培养的常规方法，从4℃冰箱取出曲霉菌（aspergillusterreus）ml-44试管斜面，在无菌条件下用接种环刮取适量孢子，划线接种于新配制的5个pda固体培养基（组成：葡萄糖2%、琼脂2%、nacl1.5%，用20%土豆的水煮液配制）平板上，28℃培养箱中活化培养5天，分别用10ml无菌水洗取孢子，并将全部孢子合并分散于100ml无菌水中，得到孢子悬液。将该孢子悬液按每瓶4ml的接种量，分别接种于装有大米固体培养基（每瓶80g市售大米加150ml天然海水，放置隔夜后于121℃灭菌30min制得）的24个1000ml三角烧瓶中，于室温静置培养35天。
2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备
将发酵物用体积分数为80％的丙酮水溶液（每瓶500ml）浸泡混悬，超声处理1h，室温浸提24h后用4层纱布过滤，重复操作3次。合并滤液，减压浓缩至不含丙酮后，残余水层约3l用等体积乙酸乙酯萃取3次，得发酵物乙酸乙酯萃取物，减压浓缩至干，得到乙酸乙酯浸膏66.2g。
3.乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有目标化合物i-iv的柱层析组分的制备
将上述乙酸乙酯浸膏66.2g用二氯甲烷-甲醇（v/v1:1）200ml溶解，滤除不溶物，加入90g层析硅胶（200-300目）吸附拌样，减压蒸干后添加到预装硅胶玻璃减压柱（120g硅胶，柱床4.8×18.0cm）上，用石油醚-二氯甲烷-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱层析，得到若干流分。根据硅胶薄层分析结果合并相应流分，按洗脱极性顺序得到8个组分：fr-1（12.4g,石油醚）、fr-2（6.3g，石油醚-二氯甲烷1:1洗脱）、fr-3（4.5g，石油醚-二氯甲烷1:2洗脱）、fr-4（11.6g，二氯甲烷洗脱）、fr-5（15.8g，二氯甲烷-甲醇99:1洗脱）、fr-6（6.2g，二氯甲烷-甲醇95:5洗脱）、fr-7（1.4g，二氯甲烷9:1洗脱）、fr-8（1.9g，二氯甲烷-甲醇7:3洗脱）。
将组分fr-3（4.5g）用50ml甲醇溶解，上样到甲醇预装的sephadexlh-20柱（柱床4.8×42cm），甲醇洗脱层析，按洗脱先后顺序将流份合并成4个子组分：fr-3-1-fr-3-5。fr-3-3（1.1g）用甲醇溶解并用0.45μm滤膜过滤后，采用quiksep中低压色谱系统（慧德易，北京，中国）以80%甲醇（流速10ml/min，室温）在预装有ods的玻璃柱（柱床1.8cm×30cm）上进行分离。根据紫外检测结果得到5个组分：fr-3-3-1-fr-3-3-5。其中，fr-3-3-1中含有目标化合物i-iv。
4.化合物i-iv的hplc制备
将含有化合物i-iv的组分fr-3-3-1（570mg）用10ml甲醇溶解，用0.45μm滤膜过滤后，用waters2545型hplc系统，利用geminic18制备柱（21.2mm×250mm）进行hplc分离（柱温26℃，以75%甲醇为流动相，流速10ml/min，每次进样0.5ml，检测波长为210和254nm)，制得化合物i（28mg，tr=17.3min）、化合物ii（118mg,tr=12.9min）、化合物iii（85mg,tr=26.8min）和化合物iv（130mg,tr=24.9min）。
化合物i-iv的理化常数与波谱数据
化合物i为无色块状结晶（meoh），m.p.172–174oc，[α]
化合物i的核磁数据经cosy、hsqc和hmbc等二维图谱分析予以归属，推出其平面结构与化合物iv（terretonind）一致；其绝对构型经noesy图谱解析和x射线单晶衍射分析鉴定为terretonind在c-14位的差向异构体。
表1化合物i-iv的1hnmr数据（500mhz，cdcl3）
化合物ii为白色粉末（meoh），[α]
化合物iii为白色粉末（meoh），[α]
化合物iv为白色粉末（meoh），[α]
表2化合物i-iv的13cnmr数据（125mhz，cdcl3）
实施例2：化合物i-iv的抗炎活性测试
1.实验材料
1)被测样品溶液的配制
测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物i-iv。精密称取适量样品，用甲醇配成所需浓度的溶液，供测试活性。
2)细胞系及细胞的继代培养
活性测试采用小鼠巨噬细胞raw264.7细胞系。raw264.7细胞用含10％胎牛血清以及青霉素和链霉素各100μg/ml的dmem培养基常规传代，并于37℃通入5％二氧化碳的细胞培养箱中培养维护。
2.活性测试方法
1)化合物对lps诱导raw264.7细胞no释放的抑制作用
采用griess法，对化合物i-iv对lps诱导raw264.7细胞no释放的抑制作用进行了测试。取对数生长期的raw264.7细胞，用新鲜dmem培养基配制细胞密度为2×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，37℃培养12h后样品组每孔加样品液各2μl，空白对照组则每孔加甲醇各2μl，于37℃处理1h，然后每孔加入lps（1μg/ml），继续培养24h。培养结束后，每孔各取上清液100μl，分别与等体积griess试剂（1%磺胺，0.1%盐酸萘乙二胺和2.5%磷酸）混合，反应后测定各孔在540nm处的吸光度值（od值）。按公式ir%＝(odlps-od样品)/(odlps-od空白)×100%计算no生成抑制率（ir%）。
2)化合物对raw264.7细胞活力的影响
采用mtt法检测化合物对raw264.7细胞活力的影响。取出100μl上清液用于测定no水平之后，每孔加预冷的5mg/ml的mtt溶液（用pbs溶液配制）各20μl，37℃孵育4h后，于4℃、2000rpm离心10min，吸去上清液，每孔各加150μldmso，置于酶标仪上充分振荡使mtt紫色产物完全溶解，测量每孔570nm处的od值。实验中样品和空白对照组均分别设三个平行孔，取od平均值，按ir%＝(od空白-od样品)/od空白×100%公式，计算样品对raw264.7细胞的抑制率（ir%）。
3.实验结果
1)mtt法测试结果
在mtt法测试中，结合显微镜观察检查，化合物i-iv在100μg/ml作用浓度下对raw264.7细胞均未显示出细胞毒性和抑制作用（表3）。
2)griess法测试结果
实验结果显示化合物i-iv在50μg/ml作用浓度下对lps诱导raw264.7细胞no释放具有显著的抑制作用（表4）。
4.结论
化合物i-iv均具有抑制lps诱导raw264.7细胞no释放的作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，表明化合物i-iv具有抗炎活性，因此化合物i-iv可用作为抗炎药物用于治疗炎症性疾病。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。