本发明涉及一种靶向多肽，具体涉及一种靶向异位atp5b通路的多肽及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤（包括白血病）是目前危害人类健康的重要病种，虽然在历经手术治疗、放射治疗、化学治疗之后，近些年在生物治疗（包括细胞治疗、免疫治疗等等）甚至靶向治疗方面取得诸多进步，但仍有相当一部分病人在各种治疗中失败。在各种初治中显效的病例，如何采取适当措施防止转移或复发，也是肿瘤治疗中需要解决的重要课题。研发更加高效或更加低廉的抗肿瘤药物，一直是该领域科学家和医疗工作者们追寻的目标。
至少50年前，学者们就意识到血小板在恶性肿瘤转移中发挥重要作用：实体肿瘤细胞进入血管后，与血液中的血小板形成聚集体（platelet-tumoraggregates，pta）；pta的形成利于肿瘤转移，而抗血小板措施可以抑制肿瘤转移。我们在研究pta形成的机制时，首次发现并证明在部分肿瘤细胞膜表面异位表达的atp5b（atpsynthaseβsubunit，atp合酶β亚基，“正常”情况下仅分布在线粒体内膜内侧），与血小板表面的糖蛋白iib（gpiib）互作，参与介导pta的形成；进一步，来自gpiib的一个序列肽段，可以高效结合在肿瘤细胞表面的atp5b上；以该多肽为靶向肽，可以将已知的毒性多肽导向至表达异位atp5b的肿瘤细胞上，从而实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。同时，实体肿瘤内部常伴随新生血管发生，现有资料表明，新生血管内皮细胞也表达异位atp5b，而正常稳态的血管内皮细胞表面则不表达异位atp5b，因此该靶向多肽还可同时实现对新生血管的靶向杀伤。
国内外研究进展简述及分析如下：
1、关于肿瘤靶向治疗
“靶向治疗”的概念和尝试最早于1980年代伴随单克隆抗体技术而出现，并随着单抗药物的普及而越发被重视。但积累的资料发现，只在肿瘤细胞表达的某种特定分子即肿瘤特异抗原（tumor-specificantigen）并不存在，而多数肿瘤相关抗原（tumor-associatedantigen）也在正常细胞表达，因此“靶向”这些分子的抗体的杀伤范围远超出肿瘤细胞，比如目前常用的rituximab会在消除高表达cd20的淋巴瘤细胞同时，也消除了同样表达cd20的正常发育阶段的b淋巴细胞，从而造成全系的免疫抑制。近年出现的嵌合抗原受体t细胞（car-t）疗法（如针对cd19的各种car-19）也存在类似局限。因此在目前阶段，仍需结合肿瘤细胞本身的特点，联合已成熟的生物技术，寻找新的肿瘤靶向治疗方案或策略。
靶向治疗是现代药物治疗的基本特征，特别是在包括血液肿瘤在内的所有肿瘤的治疗中，靶向治疗是药物研发的重点领域。现结合在血液恶性肿瘤治疗中应用的化学药、生物药的作用靶点分类（彼此有交叉），对靶向治疗的应用或研究现状及发展动态等作一分析：
2、肿瘤靶向治疗的主要靶点
目前无论已经应用于临床、正在研发、抑或仍处于基础研究阶段的肿瘤靶向治疗的靶点，基本分为三大类：（1）肿瘤细胞表面抗原：针对这一类靶点的药物或候选药物主要是单抗类制剂或其衍生物（包括fab片段、人源化改进者、与其他成分耦合者），直接对携带有特定抗原的肿瘤细胞进行攻击、杀灭。典型例子包括：抗cd20的天然单抗或人源化单抗ofatumumab，cd30单克隆抗体与vedotin构成的抗体药物brentuximabvedotin，以及针对双靶点的双特异性抗体。后者可同时识别肿瘤细胞表面抗原及ctl表面抗原，将肿瘤细胞与杀伤细胞连在一起并激活后者，从而提高杀伤效率或克服肿瘤细胞免疫逃逸机制。抗cd19/cd3双抗体、抗cd33/cd3双抗体、抗cll1/cd3双抗体、抗cd30/cdl6a的双抗体等也分别处于不同的研究阶段。（2）肿瘤密切相关的信号通路分子：这一类药物主要通过对细胞的各种信号通路进行干扰，从而实现对肿瘤细胞的治疗，如btk抑制剂ibrutinib、pkcl3抑制剂enzastaurin、、pi3k抑制剂iderlalisib或小分子抑制剂amg319、bcl.2抑制剂abt0199/abt-199、mtorcl的抑制剂everolimus、pi3k异构体兼mtorcl及torc2抑制剂sar2454096等、mdm2拮抗剂rg7112等。（3）肿瘤细胞的遗传物质：遗传物质改变（包括序列突变或表观修饰）是肿瘤发生的物质基础之一。虽然理论上可以通过纠正突变了的遗传物质而使肿瘤细胞恢复正常，但由于技术限制，在临床上并不可行；而对表观遗传则可通过药物实现调节，比如应用泛去乙酰化酶抑制剂panobinostat与其他化疗药物（异环磷酰胺+卡铂+依托泊苷）合用治疗复发难治霍奇金淋巴瘤，取得初步成效。
除此之外，还有针对机体抗肿瘤免疫细胞、或针对肿瘤细胞微环境的靶向疗法，如以抗体或其他方式抑制t细胞pd-l1／pd-1交互作用可恢复t细胞的抗肿瘤活性等，因非直接作用于肿瘤细胞，此处略。
3、血小板-肿瘤聚集机制靶点在肿瘤防治中的可能应用
3.1血小板-肿瘤聚集在肿瘤转移中的作用：血行转移是肿瘤远位转移的主要途径。早在一个世纪前人们便认识到血小板-肿瘤聚集现象的存在[1]，至1960年代意识到该机制在肿瘤转移中的重要性并开始通过干涉该机制而预防肿瘤转移[2,3]。传统认为结合在肿瘤细胞表面的血小板对转移具有促进作用，临床上应用抗血小板策略防止肿瘤转移。血小板促进肿瘤转移的机理包括：对肿瘤细胞的直接“保护伞”作用；增加肿瘤细胞或细胞团的粘性而易于向血管壁边集；介导与内皮细胞结合、释放蛋白酶类而降解内皮细胞间基质或基底膜从而使肿瘤细胞团易于迁出。单是其中“保护伞”机制，也有至少四方面因素：通过物理阻隔机制使肿瘤细胞免受免疫细胞的监视和攻击，从而有利于肿瘤细胞在血相中的存活和转移[4,5]；干扰某些细胞因子对肿瘤细胞的杀伤作用；血小板将自身表面的mhc-i类分子转移至肿瘤细胞表面，使其“伪装”成正常的细胞，从而逃避免疫细胞的识别和杀伤[6]；血小板通过直接作用诱导结合的肿瘤细胞发生上皮-间质转化，从而促进转移，并主导构建适于转移灶种植并扩张的微环境“龛”[7,8]。尽管多数证据认为血小板在肿瘤转移中起到“帮凶”作用，但也有一些证据表明结合于肿瘤细胞的血小板可能对肿瘤细胞的存活或增殖有不利的一面。比如，无论对入血的实体肿瘤细胞或起源于血液的白血病细胞，血小板均有可能诱导凋亡或直接杀伤肿瘤细胞[9,10]；但各种细胞对血小板杀伤作用的敏感性不一致，sagawa等报导血小板能够直接杀伤k562、ku812、lu99a、kgl肿瘤细胞，但是对于u937、mia、paca-2、molt-4肿瘤细胞却无效[11]。我们自己早期的工作也发现在生理范围数量的血小板可不同程度地抑制各种肿瘤细胞的增殖[12]，最近则证明结合于白血病细胞的血小板可以改变白血病细胞对化疗药物的敏感性[13]。因此血小板对其接触到的肿瘤细胞的“净”作用取决于两种作用的平衡，比如最近德国学者在小鼠肿瘤模型中证明血小板结合b16肿瘤细胞后促进肿瘤被截留在肺部，但同时也抑制肿瘤细胞的增殖[14]。
3.2血小板-肿瘤聚集机制：目前已知参与pta形成的分子约有10对，其中最主要的是膜上各种糖蛋白，有时是两种细胞膜上的同一种分子（如gpiibiiia）借由另外一个配体（如纤维蛋白）连接。虽然血小板表面的分子种类相对固定，但肿瘤细胞膜表面参与pta形成的分子谱则可能随组织来源、分化状态、甚至个体差异而不同，其中可能既有普遍表达的分子如gpiibiia，也可能有只在部分肿瘤表达的分子。如果某种分子参与pta形成且属于肿瘤相关甚至肿瘤特异抗原（即在正常组织不表达或低表达），则有可能成为通过干扰pta机制而防治肿瘤转移的靶分子。本课题组选择的异位atp5b便是如此。
3.3atp5b在肿瘤细胞膜上的异位表达：细胞能量代谢的“通用货币”是atp，催化合成atp的主要酶是位于线粒体内膜的f1f0-atp合酶。该酶由共24种蛋白组成，atp5b即为f1部分的三个β亚基。通常情况下，该酶仅分布在线粒体内膜。但das于1994年首次报道k562和a439细胞表面也存在atp5b蛋白，且该蛋白为淋巴细胞nk或lak细胞所识别[15]。随后陆续在其他肿瘤的细胞膜上检测到atp5b的存在，比如dowling比较了来自mda-mb-435s母本但侵袭力不同的两个克隆的膜蛋白，发现16种蛋白在高侵袭力克隆种表达上调，其中便包括atp5b[16]；吉林大学李一雷课题组则发现高转移性前列腺癌细胞株pc-3m中较母本株pc-3细胞的异位atp5b表达量更高[17]；魏于全、杨金亮课题组证明非小细胞肺癌和癌旁组织中异位atp5b的表达比例分别是72%（23/32例）和26%（16/62），而在鳞癌和小细胞肺癌中的比例则分别为67%（22/33例）和0%（0/10）[18]；高锋课题组则证明肿瘤细胞膜表面的atp5b由线粒体内膜转运至此，但可能与肿瘤的恶性程度无关[19]（该结论的普适性值得商榷，因为该文章用于比较恶性程度的肿瘤细胞系数量太少且来源不同，比如其中两株“高度恶性”细胞系分别为肺癌95-d和肝癌hepg2，与“低度恶性”的肺癌a549和肝细胞系l-02的可比性都较差[19]）；杨竹林课题组则在临床共126例胆囊癌病例中发现异位atp5b表达的丢失或低表达是肿瘤体积大、高tnm分级、淋巴转移、旁位侵袭的危险因素[20]。
除了肿瘤细胞外，现在已知其他细胞也可能表达异位atp5b—假如要使用肿瘤表面的异位atp5b作为治疗靶点，则其他表达异位atp5b的细胞将成为副作用的靶点，因此尤其需要注意。与肿瘤治疗靶点筛选一致的是，虽然目前已知血管内皮细胞表达异位atp5b，但目前的证据都是在原代培养或体外培养并处于对数生长期的血管内皮细而非在体的原位血管内皮细胞；目前证明血管内皮细胞上异位atp5b可作为angiostatin[21]、kringle1–5（k1–5）[22]、pigmentepitheliμm-derivedfactor即pedf[23]的受体发挥作用，这些配体与atp5b结合后导致内皮细胞增殖抑制甚至凋亡。假如异位atp5b仅在增殖的血管内皮细胞上表达而在非增殖的血管内皮细胞表达，那么肿瘤内新生血管的atp5b将可作为肿瘤治疗中的附加作用靶点而不会造成对正常血管的副作用--正如以往肿瘤治疗中的抗新生血管策略。有资料表明，原来已知针对新生血管内皮细胞的pedf，也可结合于肿瘤细胞表面的异位atp5b从而抑制肿瘤细胞的凋亡[24]，提示异位表达于不同细胞的atp5b被配体结合后可能介导相同的通路、引起相似的效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种靶向异位atp5b通路的多肽以及该多肽在制备肿瘤诊断试剂和肿瘤靶向药物中的应用。
本发明所述的靶向异位atp5b通路的多肽，其基序为nplkxdwg，其中x为缬氨酸v或甲硫氨酸m，基序的n端和/或c端连接有0或2个氨基酸。
进一步的，所述n端依次连接的两个氨基酸为脯氨酸p和缬氨酸v，所述c端依次连接的两个氨基酸为亮氨酸l和脯氨酸p。
所述多肽的氨基酸序列为seqidno.1~seqidno.8所示的氨基酸序列，具体如下所示：
n2g：nplkvdwg，
n2gm：nplkmdwg，
n2g-lp：nplkvdwg-lp，
pv-n2g：pv-nplkvdwg，
pv-n2g-lp：pvnplkvdwglp，
n2gm-lp：nplkmdwg-lp，
pv-n2gm：pv-nplkmdwg，
pv-n2gm-lp：pvnplkmdwglp。
本发明所述的靶向异位atp5b通路的多肽在制备肿瘤诊断试剂的应用。
本发明所述的靶向异位atp5b通路的多肽在制备肿瘤靶向药物的应用。
一种肿瘤靶向治疗试剂，包括本发明所述的靶向异位atp5b通路的多肽。
优选的，所述靶向异位atp5b通路的多肽偶联在活性分子上，所述活性分子包括具有治疗肿瘤作用的毒性分子。
优选的，所述靶向异位atp5b通路的多肽偶联在递药载体上，所述递药载体为纳米粒或微球。
优选的，所述靶向异位atp5b通路的多肽表达在重组毒素分子上，所述重组毒素分子由靶向异位atp5b通路的多肽对应的dna序列与蛋白类毒素分子的dna序列通过基因重组后的重组基因表达而成。
有益效果：本发明提供了一种靶向异位atp5b通路的多肽及其应用，本发明利用鼠抗人血小板膜糖蛋白gpiib的单克隆抗体（sz-22）对噬菌体展示的随机12肽文库进行三轮生物亲和淘洗筛选，对所得的克隆大量扩增后，进行dna的提取和序列测定，然后对测定的噬菌体单克隆序列进行比对得到肽段序列n2g：nplkvdwg，经人工合成后，通过流式细胞技术和westernblot技术证明该肽段n2g能够阻断鼠抗人血小板膜糖蛋白gpiib的单克隆抗体（sz-22）与正常人血小板的结合。同时，该肽段能够影响血小板的聚集功能，并减少膜糖蛋白gpiib/iiia复合物的形成。该肽段对于部分肿瘤细胞具有结合作用，且以n2g为靶向肽与已知毒性肽段klaklakklaklak构成的复合多肽（nplkvdwg-lp-klaklakklaklak）在一定浓度下能够抑制肿瘤细胞的增殖，体现了该n2g多肽在制备肿瘤诊断试剂和肿瘤靶向药物方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为phd筛选出的11条多肽的同源性比对及与cd41基因序列的比对图（在所用的phd12载体上，紧接在12肽后面的三个氨基酸是ggg，所以在h10、a11、b10三个多肽后面补位g）。
图2为流式检测多肽对鼠抗人血小板膜糖蛋白gpiib的单克隆抗体sz-22与血小板结合的阻断作用图，其中a、b图对应的sz-22抗体的浓度为0.1μg；c、d图对应的sz-22抗体的浓度为1μg。
图3为westernblot方法检测多肽对鼠抗人血小板膜糖蛋白gpiib的单克隆抗体sz-22与血小板总蛋白结合的阻断作用图，其中a、b图对应的sz-22抗体的浓度为0.1μg；c、d图对应的sz-22抗体的浓度为1μg。
图4n2g多肽（peptide8）对adp诱导的血小板聚集的抑制结果图（以血小板聚集图计算聚集率）。
图5n2g多肽（peptide8）对adp诱导的活化的抑制结果图（以pac-1染色显示血小板活化）。
图6为流式细胞仪检测fitc-n2g多肽及peptides与四种细胞结合的强度图。
图7为四种细胞与fitc-n2g多肽结合的荧光显微图。
图8为peptide1与peptide5的最大抑制浓度对比图。
图9为peptide1与peptide5对七株肿瘤细胞增殖的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：靶向异位atp5b通路的多肽序列的获得
将经过纯化的鼠抗人血小板膜糖蛋白gpiib的单克隆抗体（sz-22）与1010pfu的噬菌体展示的12肽文库（newenglandbiolabs公司产品，在m13噬菌体的piii蛋白中嵌入12氨基酸长的随机肽）室温孵育10~60min，tbst洗去未结合的噬菌体，通过甘氨酸洗脱液洗脱下结合sz-22抗体的噬菌体，经扩增滴定后进行同样的2轮淘洗和筛选，再挑选12个噬菌体单克隆进行dna的提取和序列测定，将获得的核苷酸序列翻译成多肽，对噬菌体克隆所对应的多肽序列利用ncbi数据库以及clustal软件进行同源性分析，发现其中11条肽段彼此之间高度同源，且与人cd41蛋白（gpiib）同源，比对序列为：nplkvdwg，命名为n2g多肽。（见图1）。根据其对应的gpiib的序列，分别向前和/或向后延伸两个氨基酸，或将其中的v变异为m，则分别构成如下多肽序列：
n2g：nplkvdwg；
n2gm：nplkmdwg；
n2g-lp：nplkvdwg-lp；
pv-n2g：pv-nplkvdwg；
pv-n2g-lp：pvnplkvdwglp；
n2gm-lp：nplkmdwg-lp；
pv-n2gm：pv-nplkmdwg；
pv-n2gm-lp：pvnplkmdwglp。
实施例2：合成多肽片段与血小板的结合
根据n2g序列，经化学合成多肽。从正常人外周血制备血小板并调整至合适浓度，分别将不同浓度（100μm，10μm，1μm，0.1μm，0.01μm和0μm）的n2g多肽（peptide8）与0.1μg/1μgsz-22抗体，室温孵育30-60min；加入血小板室温孵育30min后加入mtb（modifiedtyrode’sbuffer）缓冲液进行洗涤，mtb缓冲液重悬血小板，加入pe标记的羊抗鼠igg抗体作为二抗，室温避光孵育30min，加入mtb缓冲液进行洗涤，用mtb缓冲液重悬血小板并上机进行检测多肽对sz-22抗体与血小板结合的阻断程度，随机多肽peptides组及不加多肽的空白组作为阴性对照（见图2），结果表明，与不加n2g多肽的空白组及随机多肽peptides组相比，随着n2g多肽浓度的增加，其对sz-22抗体与血小板结合的阻断作用越明显，而且对低浓度但饱和的结合在血小板表面的sz-22抗体，多肽对其阻断的效果越显著。
提取正常人血小板总蛋白进行蛋白sds-page电泳，分别将不同浓度（100μm，10μm，1μm，0.1μm，0.01μm和0μm）的多肽peptide8与0.1μg/1μgsz-22抗体，4℃孵育30-60min，多肽与sz-22抗体混合物作为一抗与血小板蛋白条带进行孵育，再以hrp标记的羊抗鼠igg抗体作为二抗与之孵育，β-tubulin蛋白作为内参，曝光显影观察多肽对sz-22抗体与血小板结合的阻断程度，随机多肽peptides组及不加多肽的空白组作为阴性对照。结果（见图3）显示，与不加多肽的空白组及随机多肽peptides组相比，随着多肽浓度的增加，其对sz-22抗体与血小板结合的阻断作用也越明显，呈现剂量依赖效应，在低浓度的sz-22抗体存在的情况下，多肽对其阻断的效果要明显高于高浓度sz-22抗体存在的情况下。
实施例3：n2g多肽对血小板活化的作用
1）多肽对血小板聚集功能的影响
血小板聚集仪检测：提取正常人血小板并调整至合适浓度，血小板与10μmpeptide8多肽于室温孵育30min，血小板聚集仪用mtb缓冲液进行调零，未加多肽的空白组血小板和加入随机多肽peptides组孵育的血小板作为阴性对照，10μmadp于37℃聚集仪中刺激血小板发生聚集，血小板聚集仪观察血小板聚集的程度。结果（见图4）表明，与不加多肽的空白组及随机多肽peptides组相比，10μm多肽能够降低adp刺激血小板所引起的聚集作用。
2）多肽对血小板膜糖蛋白gpiib/iiia复合物形成的影响
流式细胞技术检测：提取正常人血小板并调整至合适浓度，血小板与10μmpeptide8多肽于室温孵育30min，未加入adp刺激组和加入10μmadp刺激组于37℃孵育30min，再加入pac-1抗体进行染色30min后，上机检测膜糖蛋白gpiib/iiia复合物的形成。结果（见图5）表明，与不加多肽的空白组、不加入adp刺激组及随机多肽peptides组相比，10μm多肽能够减少adp刺激血小板所引起膜糖蛋白gpiib/iiia复合物的形成。
实施例4：n2g多肽与肿瘤细胞的相互作用
本发明所述的n2g多肽因其本身与血小板膜糖蛋白gpiib（cd41蛋白）具有高度同源性，因此还介导血小板与肿瘤细胞的互作，并对于部分肿瘤细胞具有结合作用，且复合多肽（nplkvdwg-lp-klaklakklaklak）在一定浓度下能够抑制肿瘤细胞的增殖。
1）n2g多肽与肿瘤细胞的结合能力
肿瘤细胞（k562、nb4）以及正常的皮肤细胞（hacat）和皮肤癌细胞（a431）与10μm人工合成的带有fitc标记的peptide8多肽于4℃孵育30min，pbs洗去未结合的多肽分子，流式细胞技术检测n2g多肽与各种细胞结合的平均荧光强度。肿瘤细胞（k562、nb4）以及正常的皮肤细胞（hacat）和皮肤癌细胞（a431）与10μm人工合成的带有fitc标记的peptide8多肽于室温孵育30min，pbs洗去未结合的多肽分子，免疫荧光技术检测n2g多肽与各种细胞结合强度。结果（见图6、7）表明，与对照细胞（hacat，a431）相比，n2g多肽与肿瘤结合的平均荧光强度有所升高（图6中显示随机多肽peptides组与靶多肽peptide8组无差别，因随机多肽与靶多肽氨基酸成分相同，只是氨基酸形成肽段的位置有所变化，这可能提示肿瘤细胞对于多肽的氨基酸前后顺序的要求不是很高）。
2）复合多肽的半数抑制浓度
在噬菌体展示筛选出的多肽的基础上进行人工合成复合多肽peptide1（nplkvdwg-lp-klaklakklaklak）和对照组多肽peptide5（klaklakklaklak），进行半数抑制浓度(ic50)的测定，即采用上述mtt的方法检测不同浓度多肽（200μm，160μm，120μm，80μm，40μm，10μm，5μm，1μm，0.1μm，0.01μm，0μm）对急性早幼粒白血病细胞nb4的抑制作用，加入多肽组作为对照组。结果（见图8）表明，petide1的ic50为60.34μm。peptide5的ic50为159.6μm，复合多肽对nb4细胞的抑制作用表现出一定的剂量依赖性，随着多肽浓度的升高，其抑制率升高。而复合多肽半数抑制浓度要明显低于对照组多肽。
3）复合多肽对血液性肿瘤细胞增殖的影响
在噬菌体展示筛选出的多肽的基础上进行人工合成复合多肽，将肿瘤细胞（k562、nb4）以及正常的皮肤细胞（hacat）和皮肤癌细胞（a431）与不同浓度（10μm，1μm，0.1μm）人工合成的复合多肽peptide1及多肽peptide5于37℃分别孵育24h、48h，采用mtt法检测复合多肽在48h时对肿瘤细胞增殖的影响，加入多肽组以及不加多肽的空白组作为阴性对照。结果（见图9）显示，与加入多肽peptide5组以及不加多肽的空白组相比，复合多肽在10μm的浓度下明显的抑制了肿瘤细胞（k562、nb4）的增殖能力；但对正常的皮肤细胞（hacat）和皮肤癌细胞（a431），复合多肽peptide1无抑制作用。
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序列表
<110>苏州大学附属第一医院
<120>靶向异位atp5b通路的多肽及其应用
<141>2018-03-29
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<170>siposequencelisting1.0
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