超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺的制作方法

一、
技术领域：
：本发明涉及的是多糖提取方法，具体涉及的是超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺。二、
背景技术：
：大青叶是十字花科（cruciferae）菘蓝属（isatis）植物菘蓝（isatisindigoticafort）的干燥叶，其地下部分为板蓝根，在我国中东部分布较广。大青叶是我国传统中药，性寒、味苦、归心胃经。经研究发现，大青叶的化学成分包括有机酸、靛蓝、靛玉红、菘蓝苷、色胺酮、喹唑酮、异牡荆素、多糖等化合物。现代药理研究表明，大青叶具有清除自由基、调理血脂、抗病毒、抗菌、抗癌、增强免疫调节等作用，具有清热解毒、凉血消斑之功效，临床上可用于温病高热，神昏，发斑发疹，作腮，喉痹，丹毒，痈肿。目前对于大青叶中化学成分研究主要集中在小分子物质，缺少对于大分子多糖的研究，所以很有必要对提取大青叶多糖的方法进行研究，提高其经济利用价值。三、技术实现要素：本发明的一个目的是提供超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺，这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺用于解决从大青叶中提取的多糖问题。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂后50℃～65℃烘干，研磨过30～50目筛，加入其重量8～15倍的85%乙醇，65℃～80℃加热回流搅拌1.5h～3h，冷却后室温搅拌9h～18h，离心后残渣中分别加入其重量8～15倍的85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比20:1～35:1加入蒸馏水，75℃～90℃下回流搅拌提取50min～90min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率200w～500w、超声功率50w，继续提取30min～60min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇至乙醇浓度不低于80%，搅拌10min～30min后放入4℃冰箱中静置9h～18h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为17.50%～19.15%，大青叶多糖的得率为8.20%～10.49%。有益效果：本发明提供了一种超声-微波辅助水提醇沉法制得大青叶多糖，之后去除杂质，得到具有免疫调节活性的大青叶活性多糖的方法，提取方法简单，运行成本低，多糖生物活性高，大青叶多糖的得率达为8.20%～10.49%。四、附图说明：图1为大青叶多糖示差折光检测曲线；图2为大青叶多糖的红外光谱图；图3为大青叶多糖对巨噬细胞增殖的影响；图4为大青叶多糖对raw246.7细胞中no产量的影响。五、具体实施方式：下面结合附图对本发明做进一步的说明：实施例1：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂50℃烘干，研磨过30目筛，加入85%乙醇，65℃加热回流搅拌1.5h，冷却后室温搅拌9h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比20:1加入蒸馏水，75℃下回流搅拌提取50min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率200w、超声功率50w，继续提取30min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇体积分数为80%，搅拌10min后放入4℃冰箱中静置9h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂（sevag试剂由氯仿与正丁醇体积比为5:1混合构成）去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为17.5%，大青叶多糖的得率为8.20%。实施例2：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂后60℃烘干，研磨过40目筛，加入85%乙醇，70℃加热回流搅拌2h，冷却后室温搅拌12h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比25:1加入蒸馏水，90℃下回流搅拌提取70min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率500w、超声功率50w，继续提取50min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇体积分数为80%，搅拌10min后放入4℃冰箱中静置12h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为18.95%，大青叶多糖的得率为9.61%。实施例3：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂60℃烘干，研磨过40目筛，加入85%乙醇，75℃加热回流搅拌2h，冷却后室温搅拌15h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比25:1加入蒸馏水，80℃下回流搅拌提取70min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率300w、超声功率50w，继续提取40min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇体积分数为80%，搅拌10min后放入4℃冰箱中静置15h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为18.28%，大青叶多糖的得率为9.11%。实施例4：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂65℃烘干，研磨过50目筛，加入85%乙醇，80℃加热回流搅拌13h，冷却后室温搅拌18h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比35:1加入蒸馏水，90℃下回流搅拌提取70min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率500w、超声功率50w，继续提取50min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇体积分数为80%，搅拌20min后放入4℃冰箱中静置18h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为19.15%，大青叶多糖的得率为10.49%。实施例5：这种超声-微波辅助水提法提取大青叶活性多糖工艺：一、大青叶原料除杂65℃烘干，研磨过50目筛，加入85%乙醇，80℃加热回流搅拌13h，冷却后室温搅拌18h，离心后残渣中分别加入85%乙醇和无水丙酮室温搅拌，离心后沉淀在通风橱中自然干燥，得到脱脂大青叶；二、按照液料比30:1加入蒸馏水，90℃下回流搅拌提取55min，放入超声-微波协同萃取/反应仪中，设定微波功率500w、超声功率50w，继续提取30min；离心得到上清液，浸提两次；合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，加入乙醇使最终乙醇体积分数为80%，搅拌20min后放入4℃冰箱中静置18h；离心弃去上清液，沉淀分别加入无水乙醇和丙酮洗涤两次，离心后沉淀室温干燥，得到大青叶粗多糖；干燥提取物重新用蒸馏水溶解，利用sevag试剂去除蛋白质，3500d膜透析冻干得到大青叶多糖，大青叶粗多糖的得率为18.33%，大青叶多糖的得率为9.46%。本发明超声-微波辅助提取同其他提取方法的对比：根据公式计算大青叶粗多糖和大青叶多糖的得率，大青叶粗多糖得率（%）=（提取得到的大青叶粗多糖质量/脱脂后大青叶质量）×100，大青叶多糖得率（%）=（提取得到的大青叶多糖/脱脂后大青叶质量）×100。可知大青叶粗多糖的得率为17.50%～19.15%，大青叶多糖的得率为8.20%～10.49%。为了验证超声-微波辅助提取效果，进行了对比提取试验，超声-微波辅助提取参数为料液比25:1、温度90℃，同超声辅助、微波辅助和水提法进行对比，总提取时间2h。对比试验安排和结果见表2，可知仅利用超声辅助提取多糖得率为8.11%，仅利用微波辅助提取多糖得率是8.84%，水提法多糖得率仅为7.52%，都显著低于超声-微波协同辅助提取法（p＜0.05）的多糖得率10.49%，说明超声-微波协同萃取方法是有效的，可以显著提高大青叶多糖得率。同时进行了总提取时间85min的超声-微波协同萃取对比实验，大青叶粗多糖得率为18.33%，大青叶多糖得率为8.26%，高于水提法的多糖得率。表1对比试验安排和结果提取方法提取时间超声功率（w）微波功率（w）粗多糖得率（/%）多糖得率（/%）超声-微波辅助法水提70min，超声-微波提取50min5050019.15a10.49a超声辅助提取水提70min，超声提取50min50016.21d8.11d微波辅助提取水提70min，微波提取50min，050016.94c8.84c水提法水提120min0015.61e7.52e超声-微波辅助法（85min）水提55min，超声-微波提取30min5050018.33b9.46b注：a,b,c,d,e小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），相同表示差异不显著（p＞0.05）。下同。3、大青叶多糖化学成分和单糖组成对大青叶多糖进行化学成分和单糖组成进行检测，得知大青叶多糖化学组成包括63.8%总糖、13.1%蛋白质、14.2%硫酸根和12.6%糖醛酸。大青叶多糖中含量最高的是半乳糖33.1%，之后依次是阿拉伯糖24.6%、鼠李糖17.2%、葡萄糖12.0%、甘露糖6.2%、木糖4.5%、岩藻糖2.4%。4、大青叶多糖的分子质量及分布采用高效尺寸排阻色谱-多角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统对大青叶多糖的分子质量及分布情况进行了研究，示差折光检测曲线见图1。利用astra6.1软件进行分析，得到分子质量（mw）为785.8×103u，回转半径（rg）为183.3nm。5、大青叶多糖的红外光谱大青叶多糖经过ft-ir光谱仪扫描，红外光谱图（见图2）给出了大青叶多糖的特征吸收峰。位于3400cm-1附近宽而强的特征峰是糖分子o-h的伸缩振动引起的，表明大青叶多糖存在分子内的氢键。2920cm-1附近的一组峰是糖分子c-h的伸缩振动引起的，1630cm-1附近的一组峰是由c=o的伸缩振动引起的，1420～1220cm-1的吸收峰是c-h的变角振动，1100cm-1附近的吸收峰是c-o-c环内醚中的c-o的伸缩振动和c-o-h的o-h变角振动，通过红外光谱分析可以确定为多糖化合物。在1250cm-1附近有强吸收峰，是s=o（硫酸基）的吸收峰[25]，表明大青叶多糖中含有硫酸基，这与大青叶多糖中存在14.2%硫酸根的检测结果是吻合的。6、大青叶多糖的体外生物活性大青叶多糖的体外生物活性主要包括两个方面，一个是对于巨噬细胞raw264.7增殖能力影响，一个是激活raw264.7产生no能力。首先分析大青叶多糖对巨噬细胞raw264.7增殖能力的影响，大青叶多糖溶液（2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）加入到细胞中培养后用wst-1试剂测定吸光度，同空白组相比得到巨噬细胞相对增殖率，结果见图3。可知当大青叶多糖溶液浓度为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml时细胞增殖率分别为100.52%、101.22%和101.85%，说明在本试验所选定的浓度范围内，大青叶多糖可以促进raw264.7细胞。大青叶多糖激活raw264.7产生no能力结果见图4，大青叶多糖溶液浓度为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml时对应的no产量分别为32.41μmol/l、40.57μmol/l和42.21μmol/l，呈现剂量依赖关系，2μg/ml的处理组与另外两个浓度对应的no产量差异显著（p＜0.05）。当前第1页12