本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种yfeC/D基因敲除重组志贺氏菌的制备及应用。
背景技术：
：基因敲除是研究细菌基因功能最经典和最有效的方法，是功能基因组学研究中的一个重要技术平台，也是细菌致病机理研究中必不可少的手段之一。高通量测序技术(High-throughputsequencing)的快速发展催生了RNA-Seq(RNAsequencing)技术的出现。RNA-Seq技术首先应用并成熟于真核生物转录组的研究，在原核领域中的应用(OliverHF,OrsiRH,PonnalaL,KeichU,WangW,etal.DeepRNAsequencingofL.monocytogenesrevealsoverlappingandextensivestationaryphaseandsigmaB-dependenttranscriptomes,includingmultiplehighlytranscribednoncodingRNAs.BMCGenomics2009,10:641)，则滞后于真核生物，一个重要的原因是原核生物mRNA没有3’端多聚A尾，不便于从核糖体RNA中纯化出mRNA。2009年GordonDougan等用链特异性转录组测序方法研究了伤寒转录组数据，并与其基因组比对分析，发现40个新的候选ncRNA，对基因组注释进行了补充(Perkins,T.T.,Kingsley,R.A.,Fookes,M.C.,Gardner,P.P.,James,K.D.,Yu,L.,etal.(2009).Astrand-specificRNA-SeqanalysisofthetranscriptomeofthetyphoidbacillusSalmonellatyphi.PLoSGenet5(7),e1000569.doi:10.1371)；2015年BinLiu等人也作了福氏志贺氏菌的转录组测序分析，发现1757个基因的表达在细菌黏附宿主过程中发生变化(cutoff>2倍)(Ni,Z.,Jiang,L.,Feng,L.,Wang,L.,andLiu,B.(2015).TranscriptionaladaptationofShigellaflexneriduringadherencetoepithelialcells.JBasicMicrobiol55(2),186-194.doi:10.1002)。随着转录组测序技术在原核细菌中的应用日趋成熟和广泛，可以利用转录组测序技术，检测病原细菌在体内及体外不同环境下的差异表达，挑选重要差异基因尤其在体内表达明显上调的基因，这些基因可能是志贺氏菌毒力密切相关基因，有望作为基因敲除的靶基因，构建减毒活疫苗。技术实现要素：本发明的目的是提供一种构建重组菌的方法。本发明提供的方法，为抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达，得到重组菌。上述方法中，所述抑制或沉默福氏志贺氏菌的基因组上的yfeC/D基因表达为采用λ-red同源重组系统或sacB基因介导筛选的同源重组。上述方法中，所述抑制或沉默福氏志贺氏菌的基因组上的yfeC/D基因表达为采用λ-red同源重组系统将福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因替换为标记基因。上述方法中，所述标记基因为卡那霉素抗性基因。上述方法中，所述福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因替换为标记基因为将同源重组片段导入所述福氏志贺氏菌中；所述同源重组片段的核苷酸序列为序列1。上述方法中，所述福氏志贺氏菌为2a301野生株。由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。上述方法或上述重组菌在制备福氏志贺氏菌减毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达的物质在降低福氏志贺氏菌毒力中的应用也是本发明保护的范围；或抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达在降低福氏志贺氏菌毒力中的应用也是本发明保护的范围；或抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达的物质在制备福氏志贺氏菌减毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达的物质包括权利要求5中的所述同源重组片段。所述抑制或沉默福氏志贺氏菌基因组上的yfeC/D基因表达的物质为同源重组片段，其核苷酸序列为序列1。本发明利用λRED同源重组的方法成功敲除了301中的ebgR和yfeC/D基因，得到ebgR和yfeC/D基因缺失株，并利用豚鼠角膜实验、III型分泌系统诱导分泌及小鼠肺竞争性侵袭三个毒力评价模型，初步断定其中ebgR和yfeC/D基因缺失株的毒力有明显减弱，表明ebgR和yfeC/D基因在志贺氏菌致病过程中有可能起到重要作用，得到的ebgR和yfeC/D基因缺失株可以用作减毒疫苗的制备。附图说明图1为豚鼠角膜实验第24h和48h观察结果。图2为各菌株在CR诱导下的分泌情况。图3各缺失株与301野生株的竞争性侵袭指数。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。福氏志贺氏菌2a301野生株(萘啶酮酸抗性，Nalr)(美国sigma公司)；质粒pKD46，记载在如下文献中：Datsenko,K.A.,andWanner,B.L.(2000).One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA97(12),6640-6645.doi:10.1073/pnas.120163297.ebgR(名称DNA-bindingtranscriptionalrepressorEbgR)基因的核苷酸序列为序列6，其编码的蛋白的氨基酸序列为序列3。yfeC/D的核苷酸序列为序列7，其编码的yfeC蛋白的氨基酸序列为序列4，其编码的yfeD蛋白的氨基酸序列为序列5。实施例1、基因敲除重组菌的构建一、ebgR和yfeC/D线性打靶片段的获得ebgR线性打靶片段的核苷酸序列为序列表中序列1；其中，序列1第9-510位为ebgR基因的上游同源臂，序列1第517-2012位为kan基因，序列1第2019-2534位为ebgR基因的下游同源臂。yfeC/D线性打靶片段的核苷酸序列为序列表中序列2；其中，序列2第9-502位为yfeC/D基因的上游同源臂，序列2第509-2004位为kan基因，序列2第2011-2517位为yfeC/D基因的下游同源臂。上述线性打靶序列按照如下方法制备：以福氏志贺氏菌2a301野生株基因组为模板，用表1所示的ebgRupF和ebgRupR引物进行PCR扩增，得到ebgR基因的上游同源臂；以福氏志贺氏菌2a301野生株基因组为模板，用表1所示的ebgRdownF和ebgRdownR引物进行PCR扩增，得到ebgR基因的下游同源臂；以福氏志贺氏菌2a301野生株基因组为模板，用表1所示的yfeupF和yfeupR引物进行PCR扩增，得到yfeC/D基因的上游同源臂；以福氏志贺氏菌2a301野生株基因组为模板，用表1所示的yfedownF和yfedownR引物进行PCR扩增，得到yfeC/D基因的下游同源臂。将ebgR基因的上游同源臂、卡那霉素抗性基因和ebgR基因的下游同源臂片段通过分步酶切连接，得到ebgR线性打靶片段；将yfeC/D基因的上游同源臂、卡那霉素抗性基因和yfeC/D基因的下游同源臂片段通过分步酶切连接，得到yfeC/D线性打靶片段。表1为含上、下游同源臂线性打靶片段的扩增引物a二、ebgR基因敲除重组菌和yfeC/D基因敲除重组菌1、301/pKD46的制备将能表达重组酶蛋白(gam、bet和exo)的温敏型质粒pKD46(Ampr)电击转化入福氏志贺氏菌301野生型株的感受态细胞中，得到涂Amp抗性平板，筛选长出的单克隆经PCR验证正确得到301/pKD46；再制备301/pKD46的电转感受态，注意在收菌前1h需加入工作浓度为0.2％的L-阿拉伯糖诱导重组酶蛋白的表达。2、ebgR基因敲除重组菌的制备和yfeC/D基因敲除重组菌的制备将序列1所示的ebgR线性打靶片段电击转化301/pKD46的电转感受态，涂kan抗性平板，30℃温箱培养，对长出的单克隆进行筛选验证，采用引物ebgR外部的上游引物和kan的下游引物，得到2276bp，且用kan的上游引物和ebgR外部的下游引物进行PCR扩增，得到2325bp，符合这2个产物大小的为阳性重组菌，命名为301/pKD46△ebgR。将序列2所示的yfeC/D线性打靶片段电击转化301/pKD46的电转感受态，涂kan抗性平板，30℃温箱培养，对长出的单克隆进行筛选验证，采用引物yfeC/D外部的上游引物和kan的下游引物，得到2311bp，且用kan的上游引物和yfeC/D外部的下游引物进行PCR扩增，得到2386bp，符合这2个产物大小的为阳性重组菌，命名为301/pKD46△yfeC/D。表2为基因缺失的验证引物将上述重组菌301/pKD46△ebgR和301/pKD46△yfeC/D在42℃中摇菌过夜驱除温敏型质粒pKD46，得到ebgR基因缺失的重组菌301△ebgR和yfeC/D基因缺失的重组菌301△yfeC/D。ebgR基因缺失的重组菌301△ebgR为用卡那霉素抗性基因替换福氏志贺氏菌301野生型株基因组的ebgR基因部分片段(序列6的第87-906位)得到的重组菌(ebgR基因的头86bp和尾78bp由于分别在上下游同源臂中，未被敲除)。yfeC/D基因缺失的重组菌301△yfeC/D为用卡那霉素抗性基因替换福氏志贺氏菌301野生型株基因组的yfeC/D基因部分片段(序列7的第53-645位)得到的重组菌(yfeC/D基因的头52bp和尾100bp由于分别在上下游同源臂中，未被敲除)。实施例2、基因敲除重组菌的毒力检测1、豚鼠角膜实验(Sereny试验)在新鲜TSA平板上挑取志贺氏菌301野生株以及实施例1获得的重组菌301△ebgR和重组菌301△yfeC/D的单菌落接种于含相应抗生素的LB试管中，过夜培养(30℃)后按1％转接，继续培养(37℃)至对数生长期(7h)。各菌株均收集1mL菌液(活菌计数约为2×109)，室温下离心，7000r/min，1min，生理盐水洗两次后再重悬于20μL的生理盐水，全部滴入健康成年豚鼠的角膜上(体重约250g，角膜与结膜外观正常)的角膜中，得到滴入志贺氏菌301野生株豚鼠、滴入志贺氏菌缺失株301△ebgR豚鼠和滴入志贺氏菌缺失株301△yfeC/D豚鼠。每隔12h观察豚鼠角膜变化，并照相。根据豚鼠角膜有没有变灰白，结膜有无红肿，是否有脓性分泌等判断各菌株对豚鼠角膜的毒力情况。如图1所示，1、2、3号分别为接种301、301△ebgR、301△yfeC/D的豚鼠,可以看出，到第24h时，编号为编号为2和3的缺失株301△ebgR和301△yfeC/D眼睛仍正常(红色箭头)，滴入志贺氏菌301野生株豚鼠已经开始出现明显的脓性分泌(蓝色箭头)；第48h时，滴入志贺氏菌缺失株301△ebgR豚鼠和滴入志贺氏菌缺失株301△yfeC/D豚鼠轻微的结膜红肿，滴入志贺氏菌301野生株豚鼠眼睛出现较多的脓性分泌。从该毒力实验表型来看，缺失基因的重组菌301△ebgR和重组菌301△yfeC/D的细菌毒力明显减弱。2、刚果红诱导分泌检测相关基因缺失后能否在CR诱导下继续分泌毒力相关的效应分子，方法如下：在新鲜TSA平板上挑取志贺氏菌301野生株以及实施例1获得的重组菌301/△ebgR和重组菌301/△yfeC/D接种于含相应抗生素的LB试管中，过夜培养(30℃)后按1％转接到BHI试管，继续培养(37℃)至对数生长期(约4-5h)，各菌株5mL低温离心收集菌块，预冷PBS洗两次后，悬于200μL的预冷PBS，加入终浓度0.01％的刚果红(CR)，37℃摇床诱导30min，诱导完成后，13000r/min离心，收集上清用0.22μm的滤器过滤，得到的上清样品加入等体积的2×SDSloadingbuffer混合均匀，沸水煮10min，然后进行SDS-PAGE电泳。程序为80V20min，120V至溴酚蓝指示剂刚电泳出胶。结果如图2所示，1为志贺氏菌301野生株、2为志贺氏菌缺失株301△ebgR豚鼠、3为志贺氏菌缺失株301△yfeC/D豚鼠；可以看出，缺失株301△ebgR和301△yfeC/D，基本没有毒力蛋白的分泌，暗示基因ebgR和yfeC/D缺失后导致细菌毒力减弱。3、小鼠肺竞争性侵袭在新鲜TSA平板上挑取志贺氏菌301野生株以及实施例1获得的重组菌301/△ebgR和重组菌301/△yfeC/D的单菌落接种于含相应抗生素的LB试管中，过夜培养(30℃)后按1％转接，继续培养(37℃)至对数生长期(7h)。各菌株均收集含相同菌量的菌液约1mL，计算每1mL菌中的活菌数，离心去上清，用生理盐水洗菌一次，再用1mL生理盐水重悬；再等体积两两混合301野生株与各缺失株，混合后悬至30μL；4-5周龄的Balb/c小鼠用10％的水合氯醛经腹腔注射麻醉，各取约108CFU的菌液鼻腔滴入3只经水合氯醛麻醉的Balb/c小鼠肺部，进行肺组织感染，4h后对每只小鼠肌肉注射庆大霉素40μL(4万U/mL)。24h后，处死小鼠打开胸腔取肺组织，生理盐水漂洗双肺组织后用移入碾磨器中，对肺组织碾磨匀浆，匀浆液7000r/min离心后，再用生理盐水漂洗两次。向沉淀中加入1mL过滤除菌的0.1％脱氧胆酸钠(DOC)破碎肺组织细胞使其中的细菌释放出来，一定比例稀释后涂Nal抗性的LB平板(每个重复涂三块平板)，长出的克隆先用细菌计数器计数，可计算细菌的回收率。再挑取单菌落点含kan抗生素的LB平板，37℃温箱培养过夜，Kan抗性平板长出的认为是基因缺失株，再对点板后长出的克隆计数，依据公式(侵袭后突变株菌数/侵袭后野生株菌数)/(侵袭前突变株菌数/侵袭前野生株菌数)计算竞争性侵袭指数。每个缺失株与野生株301进行等量混合侵袭小鼠肺部的实验，分别为301与301△ebgR、301△yfe(每组混合菌各侵袭三只小鼠的双肺，即3×2＝6只小鼠)。实验中首先将37℃中培养至对数中期(约7h)的细菌，进行梯度稀释涂布，计算每1mL菌中的活菌数，再等体积两两混合301野生株与各缺失株，混合后悬至30μL，每只小鼠经鼻滴入10μL，通过之前各菌活菌计数及简单计算，使滴入小鼠鼻腔的混合菌在108水平(根据预实验的结果，每1mL菌液的活菌数在109水平，原菌液洗后各悬至1mL生理盐水震荡均匀，再分别取150μL的301野生株分别与150μL的各缺失株混合震荡混匀，离心去上清后各混合菌悬至30μL，并吹匀)。细菌经鼻进入小鼠肺，侵袭24h后处死小鼠，取出肺组织碾磨，将回收的细菌涂Nal抗性平板，对长出的活菌进行计数，可计算细菌侵袭小鼠肺后的细菌回收率。计数后选择kan抗性平板进行点板，Kan抗性平板长出的认为是基因缺失株，最后计算竞争性侵袭指数。结果见表3及4。表3野生株与各缺失株侵袭前计数各菌株301301△ebgR301△yfeC/D侵袭前计数(108)535248表4混合菌侵袭小鼠肺竞争性指数计算混合菌301+△ebgR301+△yfeC/DNal板回收菌量(102)627；622；-c1014；872；-回收率a0.0119％；0.0118％0.0201％；0.0173％点kan板长出菌落10/100；6/10017/100；15/100缺失株竞争性指数b0.113；0.0650.226；0.195a回收率的计算：混合菌回收的菌落数/混合菌滴鼻的菌落数。如301+301△ebgR混合菌第一只小鼠肺侵袭的回收率为：627×102/0.05(53+52)×108＝0.0119％。b缺失株竞争性指数的计算：(侵袭后突变株菌数/侵袭后野生株菌数)/(侵袭前突变株菌数/侵袭前野生株菌数)。如301+301△ebgR混合菌第一只小鼠肺侵袭的竞争性指数为：(10/90)/(52/53)＝0.113c“-”指从该小鼠肺部未回收到细菌，下同。上述表中，回收率和竞争性指数的计算，都按照每只小鼠为个体进行统计计算，可以看出，各缺失株中，仅301△ebgR和301△yfe其竞争性侵袭指数与301相比明显较低，说明这两个基因的可能与志贺氏菌毒力调控相关。各缺失株与301野生株的竞争性侵袭指数作图如图3所示，取底为2的对数后，301ΔebgR的log2CI小于-3，说明其侵袭力相比301野生株降低8倍以上；301ΔyfeC/D的log2CI小于-2，说明其侵袭力相比301野生株降低4倍以上。从小鼠肺侵袭结果来看，仅ebgR缺失株的竞争性侵袭指数(两只小鼠，分别为0.113和0.065)，及yfeC/D缺失株的竞争性侵袭指数(一只小鼠，为0.226)相对于301野生株明显较低，说明这两个基因的缺失株其毒力有所减弱。上述结果发现，ebgR和yfeC/D基因缺失株在豚鼠角膜实验中对豚鼠眼睛的毒力损伤明显比野生株发生较轻，发展较慢；同样，在III型分泌系统诱导的分泌上，也是ebgR和yfeC/D基因缺失株没有诱导的条带；在小鼠肺竞争性侵袭实验中，相比301野生株，竞争性指数明显较低的缺失株也是301△ebgR和301△yfeC/D；说明ebgR和yfeC/D这两个基因与志贺氏菌的毒力密切相关。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>yfeCD基因敲除重组志贺氏菌的制备及应用<160>7<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2542<212>DNA<213>1<400>1gcggatcccataagaccaccaccgttttccccatcagctcctcttcgctgtagtacggca60ccaggctggtcacggtttgcagtgttttttccccacatcaacctgtacgatgtacagctt120gtcggcgttttcatggcgtttcacttccacaatctttccgacgcgcatttccagacgtgc180aaaatcagcgtaagccacggtttccattgcttcctcccttcgagtaaaattttactaaac240tatagaaaagtttttctcaatcctgtaggctaaaaatggagaatgcaggcgtgatcacat300tcctaagccgctgtgttaccgttacagcgtcaaagaaacgcgctttatttactgaaaaca360ggtgacccgataagcacttcctctacaatgggggcgcacatcagggaaagtaaaaaaggt420aaacatggcaacattaaaagacatcgcaatcgaagctggcgtatccctggcgacagtatc480cagggtcttaaatgacgatccgacattgaagtcgacgtgtaggctggagctgcttcgaag540ttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatcccctcacgct600gccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtc660cgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaa720acgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagact780gggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaagg840ttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgca900ggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatg960gattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcac1020aacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccgg1080ttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgc1140ggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactg1200aagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctc1260accttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgc1320ttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgta1380ctcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcg1440cgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcg1500tgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggat1560tcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctaccc1620gtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggta1680tcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgag1740cgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagattt1800cgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccgg1860ctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaa1920aagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaagga1980ggatattcatatggaccatggctaattcccataagcttgctgctagtcttcgttcccagc2040aaattaaaactgcgcggcacgacccgttaaatccccttacacactgttcggcaatcattt2100ttgccggacagtgctgccgtttattttcgtgatccagttaaagtaaatgcatttacctgc2160tgctttttagtaaaaattttactaaacccccagcaattacacaaactaccatcaccatga2220atggttccgatttctctctaccgggaggccctatgaatcgctgggaaaacattcagctca2280cccacgaaaaccgacttgcgccgcgtgcgtactttttttcatatgattctgttgcgcaag2340cgcgtacctttgcccgcgaaaccagcagcctgtttctgcccttaagcagtcagtggaatt2400tccacttttttgaccatccgctgcaagtaccagaagccttcacctctgagttaatggctg2460actgggggcatattaccgtccccgccatgtggcaaa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