本发明涉及细胞培养领域，更具体的，本发明涉及用于保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性的无血清培养基。
背景技术：
在全球生物制药市场中，抗体药物是最重要的一个种类，该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，其代表了药品治疗领域的最新发展方向，尤其在抗肿瘤和自身免疫系统缺陷的治疗领域有着无限的市场前景。截止2016年，全球已有61个抗体药物上市，年销售额达900亿美元，近10年年均复合增长率达到31.65％。这些数据均体现出抗体药物广大的市场前景和迅猛的发展势头。
动物细胞培养技术是目前工业化生产抗体药物的关键技术之一。抗体是由两条重链和两条轻链通过二硫键链接而成的一种免疫球蛋白，包括能够与抗原特异性结合的Fab片段和能够与蛋白A结合的Fc片段。抗体药物临床治疗的有效性和安全性与其空间结构有着极其紧密的联系，其链间和链内的二硫键连接对维持抗体空间结构及稳定性具有非常重要的作用。二硫键的断裂将导致抗体空间结构的改变或缺失，直接影响产品的有效性和安全性。例如轻重链间二硫键的断裂将导致抗体的Fab片段无法特异性识别抗原，从而显著降低该抗体药物的有效性。此外，因二硫键断裂抗体药物暴露的半胱氨酸残基与其他蛋白的半胱氨酸残基结合形成二硫键，产生的大分子聚合物在体内具有免疫源性，将直接影响抗体药物的安全性。现如今，在众多动物细胞培养生产抗体药物的过程中，均出现明显的抗体药物链间二硫键断裂形成片段化的现象。综上所述，由于抗体二硫键的断裂能显著影响抗体类药物安全性和有效性，如何保护细胞培养过程中抗体二硫键的完整性是目前亟待解决的问题。
抗体二硫键的断裂主要发生在胞外阶段。由于胞外环境恶劣(不适宜的温度/pH，复杂的化学组成等)，当修饰成熟的抗体分子经分泌小泡分泌到动物细胞外后抗体中链间和链内的二硫键连接可能出现断裂问题。目前，广为人们所接受的二硫键断裂理论主要分为两种：基于硫氧还蛋白系统的酶催化断裂和氧化还原物质介导的非酶催化断裂。基于硫氧还蛋白系统的酶催化断裂包括两个步骤：硫氧还蛋白还原酶首先从还原型辅酶Ⅱ得到电子，成为还原型硫氧还蛋白还原酶。其次还原型硫氧还蛋白将所得电子传递给抗体链间或链内的二硫键使其发生断裂，自身变为氧化型硫氧还蛋白还原酶。此过程所涉及的物质包括葡萄糖、6-磷酸葡萄糖和还原型辅酶Ⅱ等，而在无血清培养基中均会添加上述物质以支持细胞对碳水化合物和能量的需求。另外，从化学反应的角度，二硫键断裂属于氧化还原反应，因此培养基中所添加的氧化还原物质会介导非酶催化的二硫键断裂。培养基中维生素E为还原性物质，而五水硫酸铜为氧化性物质，这些物质在同一体系中共存极易出现电子传递的现象，可能导致抗体二硫键的断裂。Perrin等的研究证明某些氨基酸的侧链会将本身电子传递给金属离子，使金属离子形成低价的中间体。耿佃亮等从氧化还原热力学计算方面证明了部分氨基酸(组氨酸、精氨酸等)在金属离子催化下，表现出还原性质。Daide和Liebler都报道维生素C和维生素E等在体外均呈现很强的抗氧化性。综上所述，无血清培养基中添加组分和浓度均会介导基于硫氧还蛋白系统的酶催化断裂和氧化还原物质介导的非酶催化断裂过程进而破坏抗体高级结构，导致抗体药物出现安全性和有效性的问题。
目前提出的保护抗体二硫键完整性方案多局限于动物细胞培养过程之后的固液分离和纯化阶段，其弊端是一方面增加了纯化阶段的成本，另一方面损耗了抗体药物的滴度。而目前对动物细胞培养过程特别是无血清培养基的设计认识甚少，现阶段尚未有保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性的无血清培养基的报道。
因此，无血清培养基的优化设计对于保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性的无血清培养基。
本发明的第一方面，提供一种固态无血清培养基，所述培养基包括：还原性物质、中性物质和氧化性物质，其中，
所述还原性物质包括：亚硒酸钠、七水硫酸亚铁、L-盐酸精氨酸、L-盐酸半胱氨酸、L-盐酸组氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-酪氨酸钠盐、抗坏血酸、核黄素、视黄醇、生育酚、葡萄糖、二硫苏糖醇、白蛋白、硫辛酸和还原型谷胱甘肽；所述中性物质包括：无水氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸钠、L-一水天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、丙酮酸钠、半乳糖、亚油酸、胆固醇、氢化可的松、腐胺、嵌段式聚醚F-68、吐温80、转铁蛋白、氢氧化钠、胰岛素和酚红；所述氧化性物质包括：九水硝酸铁、柠檬酸铵铁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、四水氯化锰、六水氯化铬、六水氯化钴、五水氯化锡和L-盐酸胱氨酸。
在另一优选例中，所述培养基中包含具有以下重量份的还原性物质：
亚硒酸钠 0.01-20(较佳0.05-15或0.1-10)；
七水硫酸亚铁 0.1-20(较佳0.2-15或0.5-10)；
L-盐酸精氨酸 10-250(较佳20-200或30-180或40-180)；
L-盐酸半胱氨酸 30-400(较佳45-350或60-300)；
L-盐酸组氨酸 10-280(较佳20-250或30-240)；
L-盐酸赖氨酸 70-500(较佳80-480或90-450)；
L-丝氨酸 20-350(较佳30-300)；
L-苏氨酸 30-450(较佳40-400)；
L-色氨酸 10-400(较佳20-350)；
L-脯氨酸 60-480(较佳65-450或70-400)；
L-酪氨酸钠盐 60-500(较佳70-480或80-450)；
抗坏血酸 10-180(较佳15-150或20-120)；
核黄素 0.1-15(较佳0.25-10或0.5-8)；
视黄醇 4-30(较佳4.5-25或5-20)；
生育酚 4-30(较佳4.5-25或5-20)；
葡萄糖 1500-10000(较佳2000-9500或2500-9000)；
二硫苏糖醇 80-400(较佳100-350或120-300)；
硫辛酸 1.5-30(较佳2-25或2.5-20)；
还原型谷胱甘肽 50-2000(较佳80-1500或100-1200)；
白蛋白 0.1-20(较佳0.2-15或0.3-10)。
在另一优选例中，所述培养基中包含具有以下重量份的中性物质：
无水氯化钙 30-750(较佳50-500或60-450)；
氯化钾 50-2500(较佳80-2000或100-1850)；
无水硫酸镁 20-250(较佳30-300或50-270)；
氯化钠 500-8000(较佳800-7000或1000-6500)；
无水磷酸二氢钠 25-700(较佳40-500或50-460)；
无水磷酸氢二钠 25-700(较佳40-500或50-460)；
碳酸氢钠 600-6000(较佳800-5500或1000-5000)；
L-谷氨酰胺 80-2000(较佳100-1500或120-1400)；
L-谷氨酸钠 30-800(较佳50-650或60-600)；
L-一水天冬酰胺 80-2000(较佳100-1700或150-1500)；
L-天冬氨酸 50-1000(较佳80-750或100-700)；
甘氨酸 10-500(较佳10-300或20-260)；
L-异亮氨酸 10-750(较佳25-500或50-460)；
L-亮氨酸 35-750(较佳55-650或60-630)；
L-甲硫氨酸 5-700(较佳10-650、15-610或20-600)；
L-苯丙氨酸 10-750(较佳10-550、15-510或30-500)；
L-缬氨酸 40-600(较佳45-500或60-450)；
D-泛酸钙 1-60(较佳1.5-50或2-45)；
氯化胆碱 1-60(较佳1.2-50或1.5-45)；
叶酸 1-60(较佳1.2-50或1.5-46)；
肌醇 4.5-120(较佳5-100或5.5-92)；
烟酰胺 2-60(较佳2.5-50或3.0-48)；
盐酸硫胺 2-60(较佳2.5-50或3-45)；
盐酸吡哆醇 2-60(较佳2.5-50或3-46)；
丙酮酸钠 5-1500(较佳10-1000或15-900)；
半乳糖 50-5500(较佳80-5000或100-4500)；
亚油酸 0.2-55(较佳0.5-40或1-35)；
胆固醇 1-65(较佳2.5-60或3-54)；
氢化可的松 1.5-35(较佳1.5-35或2-31)；
腐胺 1-35(较佳1.5-32或2-29)；
嵌段式聚醚F-68 0.2-60(较佳0.5-50或1-46)；
吐温80 0.5-70(较佳1-60或1.5-58)；
氢氧化钠 50-1000(较佳80-950或100-930)；
转铁蛋白 0.5-60(较佳1.0-40或2-36)；
胰岛素 0.5-70(较佳1.0-60或2-53)；
酚红 3.5-70(较佳4.5-50或5-46)。
在另一优选例中，所述培养基中包含具有以下重量份的氧化物质：
九水硝酸铁 0.05-25(较佳0.1-20或0.3-16)；
柠檬酸铵铁 5-75(较佳8-70或10-67)；
五水硫酸铜 0.01-15(较佳0.05-10或0.1-9)；
七水硫酸锌 0.05-50(较佳1.0-40或2-37)；
四水氯化锰 0.001-5(较佳0.05-2或0.01-1)；
六水氯化铬 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
六水氯化钴 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
五水氯化锡 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
L-盐酸胱氨酸 40-600(较佳50-500或55-480)。
本发明的第二方面，提供一种液态无血清培养基，所述培养基包括：还原性物质、中性物质、氧化性物质和水；
所述还原性物质包括：亚硒酸钠、七水硫酸亚铁、L-盐酸精氨酸、L-盐酸半胱氨酸、L-盐酸组氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-酪氨酸钠盐、抗坏血酸、核黄素、视黄醇、生育酚、葡萄糖、二硫苏糖醇、白蛋白、硫辛酸和还原型谷胱甘肽；
所述中性物质包括：无水氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸钠、L-一水天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、丙酮酸钠、半乳糖、亚油酸、胆固醇、氢化可的松、腐胺、嵌段式聚醚F-68、吐温80、转铁蛋白、氢氧化钠、胰岛素和酚红；
所述氧化性物质包括：九水硝酸铁、柠檬酸铵铁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、四水氯化锰、六水氯化铬、六水氯化钴、五水氯化锡和L-盐酸胱氨酸。
在另一优选例中，所述还原性物质的浓度范围如下，单位毫克/升：
亚硒酸钠 0.01-20(较佳0.05-15或0.1-10)；
七水硫酸亚铁 0.1-20(较佳0.2-15或0.5-10)；
L-盐酸精氨酸 10-250(较佳20-200或30-180或40-180)；
L-盐酸半胱氨酸 30-400(较佳45-350或60-300)；
L-盐酸组氨酸 10-280(较佳20-250或30-240)；
L-盐酸赖氨酸 70-500(较佳80-480或90-450)；
L-丝氨酸 20-350(较佳30-300)；
L-苏氨酸 30-450(较佳40-400)；
L-色氨酸 10-400(较佳20-350)；
L-脯氨酸 60-480(较佳65-450或70-400)；
L-酪氨酸钠盐 60-500(较佳70-480或80-450)；
抗坏血酸 10-180(较佳15-150或20-120)；
核黄素 0.1-15(较佳0.25-10或0.5-8)；
视黄醇 4-30(较佳4.5-25或5-20)；
生育酚 4-30(较佳4.5-25或5-20)；
葡萄糖 1500-10000(较佳2000-9500或2500-9000)；
二硫苏糖醇 80-400(较佳100-350或120-300)；
硫辛酸 1.5-30(较佳2-25或2.5-20)；
还原型谷胱甘肽 50-2000(较佳80-1500或100-1200)；
白蛋白 0.1-20(较佳0.2-15或0.3-10)。
在另一优选例中，所述中性物质的浓度范围如下，单位毫克/升：
无水氯化钙 30-750(较佳50-500或60-450)；
氯化钾 50-2500(较佳80-2000或100-1850)；
无水硫酸镁 20-250(较佳30-300或50-270)；
氯化钠 500-8000(较佳800-7000或1000-6500)；
无水磷酸二氢钠 25-700(较佳40-500或50-460)；
无水磷酸氢二钠 25-700(较佳40-500或50-460)；
碳酸氢钠 600-6000(较佳800-5500或1000-5000)；
L-谷氨酰胺 80-2000(较佳100-1500或120-1400)；
L-谷氨酸钠 30-800(较佳50-650或60-600)；
L-一水天冬酰胺 80-2000(较佳100-1700或150-1500)；
L-天冬氨酸 50-1000(较佳80-750或100-700)；
甘氨酸 10-500(较佳10-300或20-260)；
L-异亮氨酸 10-750(较佳25-500或50-460)；
L-亮氨酸 35-750(较佳55-650或60-630)；
L-甲硫氨酸 5-700(较佳10-650、15-610或20-600)；
L-苯丙氨酸 10-750(较佳10-550、15-510或30-500)；
L-缬氨酸 40-600(较佳45-500或60-450)；
D-泛酸钙 1-60(较佳1.5-50或2-45)；
氯化胆碱 1-60(较佳1.2-50或1.5-45)；
叶酸 1-60(较佳1.2-50或1.5-46)；
肌醇 4.5-120(较佳5-100或5.5-92)；
烟酰胺 2-60(较佳2.5-50或3.0-48)；
盐酸硫胺 2-60(较佳2.5-50或3-45)；
盐酸吡哆醇 2-60(较佳2.5-50或3-46)；
丙酮酸钠 5-1500(较佳10-1000或15-900)；
半乳糖 50-5500(较佳80-5000或100-4500)；
亚油酸 0.2-55(较佳0.5-40或1-35)；
胆固醇 1-65(较佳2.5-60或3-54)；
氢化可的松 1.5-35(较佳1.5-35或2-31)；
腐胺 1-35(较佳1.5-32或2-29)；
嵌段式聚醚F-68 0.2-60(较佳0.5-50或1-46)；
吐温80 0.5-70(较佳1-60或1.5-58)；
氢氧化钠 50-1000(较佳80-950或100-930)；
转铁蛋白 0.5-60(较佳1.0-40或2-36)；
胰岛素 0.5-70(较佳1.0-60或2-53)；
酚红 3.5-70(较佳4.5-50或5-46)。
在另一优选例中，所述氧化性物质的浓度范围如下，单位毫克/升：
九水硝酸铁 0.05-25(较佳0.1-20或0.3-16)；
柠檬酸铵铁 5-75(较佳8-70或10-67)；
五水硫酸铜 0.01-15(较佳0.05-10或0.1-9)；
七水硫酸锌 0.05-50(较佳1.0-40或2-37)；
四水氯化锰 0.001-5(较佳0.05-2或0.01-1)；
六水氯化铬 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
六水氯化钴 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
五水氯化锡 0.0001-0.5(较佳0.005-0.2或0.001-0.1)；
L-盐酸胱氨酸 40-600(较佳50-500或55-480)。
在另一优选例中，所述水为超纯水。
在另一优选例中，所述水为无热原超纯净水。
本发明的第三方面，提供一种动物细胞体外培养方法，所述方法包括采用第一方面所述的培养基或第二方面所述的培养基中接种所述动物细胞并进行培养。
在另一优选例中，所述第一方面所述的培养基事先溶于水或磷酸缓冲盐溶液中配制成液态培养基。较佳，溶于水。
在另一优选例中，所述动物细胞是用于生产抗体药物的动物细胞。
在另一优选例中，所述动物细胞是表达抗体药物的CHO细胞。
本发明的第四方面，提供第一方面或第二方面所述的培养基的用途，用于动物细胞体外培养，保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性。
在另一优选例中，所述动物细胞是用于生产抗体药物的动物细胞。
在另一优选例中，所述动物细胞是表达抗体药物的CHO细胞。
本发明的第五方面，提供一种保护抗体二硫键完整性的方法，其特征在于，在动物细胞培养过程中，使用第一方面或第二方面所述的培养基。
在另一优选例中，所述动物细胞是用于生产抗体药物的动物细胞。
在另一优选例中，所述动物细胞是表达抗体药物的CHO细胞。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明的无血清培养基组分明确，减少血清带来的污染源；
(2)本发明的无血清培养基能够支持动物细胞的快速生长和高密度维持以及抗体药物的表达；
(3)本发明的无血清培养基很好地保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性，提高完整抗体的含量；
(4)本发明的培养基具有普适性，配制简便、成本可控，容易实施和推广应用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合，从而构成新的或优选的技术方案。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为CHO细胞在无血清培养基I中进行培养的细胞生长情况和抗体表达情况。
图2为CHO细胞在无血清培养基I中表达的抗体经Protein A一步纯化后进行抗体二硫键完整性检测的结果。
图3为CHO细胞在无血清培养基II中进行培养的细胞生长情况和抗体表达情况。
图4为CHO细胞在无血清培养基II中表达的抗体经Protein A一步纯化后进行抗体二硫键完整性检测的结果。
图5为CHO细胞在无血清培养基III中进行培养的细胞生长情况和抗体表达情况。
图6为CHO细胞在无血清培养基III中表达的抗体经Protein A一步纯化后进行抗体二硫键完整性检测的结果。
图7为CHO细胞在无血清培养基C1中进行培养的细胞生长情况和抗体表达情况。
图8为CHO细胞在无血清培养基C1中表达的抗体经Protein A一步纯化后进行抗体二硫键完整性检测的结果。
图9为CHO细胞在商业培养基C2中进行培养的细胞生长情况和抗体表达情况。
图10为CHO细胞在商业培养基C2中表达的抗体经Protein A一步纯化后进行抗体二硫键完整性检测的结果。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种用于保护动物细胞培养过程中抗体二硫键完整性的无血清培养基。在此基础上，完成了本发明。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
一种适合CHO细胞培养，并有效保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键完整性、减少片段化含量的无血清培养基，包括还原性物质、中性物质和氧化性物质，各成分的含量如下，单位毫克/升：
亚硒酸钠 0.1，
七水硫酸亚铁 0.5，
L-盐酸精氨酸 40，
L-盐酸半胱氨酸 60，
L-盐酸组氨酸 30，
L-盐酸赖氨酸 90，
L-丝氨酸 30，
L-苏氨酸 40，
L-色氨酸 20，
L-脯氨酸 70，
L-酪氨酸钠盐 80
抗坏血酸 20，
核黄素 0.5，
视黄醇 5.0，
生育酚 5.0，
葡萄糖 2500，
二硫苏糖醇 120，
硫辛酸 2.5，
还原型谷胱甘肽 100，
白蛋白 0.3，
无水氯化钙 60，
氯化钾 100，
无水硫酸镁 50，
氯化钠 6500，
无水磷酸二氢钠 50，
无水磷酸氢二钠 50，
碳酸氢钠 1000，
L-谷氨酰胺 120，
L-谷氨酸钠 60，
L-一水天冬酰 胺150，
L-天冬氨酸 100，
甘氨酸 20，
L-异亮氨酸 50，
L-亮氨酸 60，
L-甲硫氨酸 20，
L-苯丙氨酸 30，
L-缬氨酸 60，
D-泛酸钙 2.0，
氯化胆碱 1.5，
叶酸 1.5，
肌醇 5.5，
烟酰胺 3.0，
盐酸硫胺 3.0，
盐酸吡哆醇 3.0，
丙酮酸钠 15，
半乳糖 100，
亚油酸 1.0，
胆固醇 3.0，
氢化可的松 2.0，
腐胺 2.0，
嵌段式聚醚F-68 1.0，
吐温80 1.5，
氢氧化钠 100，
转铁蛋白 2.0，
胰岛素 2.0，
酚红 5.0，
九水硝酸铁 0.3，
柠檬酸铵铁 10，
五水硫酸铜 0.1，
七水硫酸锌 2.0，
四水氯化锰 0.01，
六水氯化铬 0.001，
六水氯化钴 0.001，
五水氯化锡 0.001，
L-盐酸胱氨酸 55，
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，简称CHO细胞)悬浮培养且能降低蛋白片段化含量的无血清培养基I。
使用无血清培养基I，将表达抗体药物的CHO细胞以1.00×106cells/ml的密度，大于95％的活性稀释接种于荷兰Applicon公司生产的3L反应器中，进行培养。反应器参数设置为：搅拌转速—140-160转/分，pH—6.6-7.0，溶氧—20％-80％，温度—36-37度。培养14天后，采用离心加过滤的方式收集培养上清液，使用Protein-A亲和层析方式对抗体药物进行纯化收集，使用非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳的检测方法(简称非还原CE-SDS)对抗体完整性进行检测。结果如附图1和附图2所示。附图1中：■为活细胞密度曲线；▲为蛋白产量曲线；附图2中：黑色柱状图为非还原CE-SDS检测结果，包括完整抗体的含量和片段化含量。
从图1中的曲线可以得知，培养基I能够良好地支持细胞的正常生长和抗体的表达，图2表明培养基I能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，使经过一步亲测层析纯化后完整抗体的含量高于95％。
实施例2
一种适合CHO细胞培养，并有效保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键完整性、减少片段化含量的无血清培养基，包括还原性物质、中性物质和氧化性物质，各成分的含量如下，单位毫克/升：
亚硒酸钠 10，
七水硫酸亚铁 10，
L-盐酸精氨酸 180，
L-盐酸半胱氨酸 300，
L-盐酸组氨酸 230，
L-盐酸赖氨酸 450，
L-丝氨酸 300，
L-苏氨酸 400，
L-色氨酸 350，
L-脯氨酸 400，
L-酪氨酸钠盐 450
抗坏血酸 120，
核黄素 8.0，
视黄醇 20，
生育酚 20，
葡萄糖 9000，
二硫苏糖醇 300，
硫辛酸 20，
还原型谷胱甘肽 1200，
白蛋白 10，
无水氯化钙 450，
氯化钾 1850，
无水硫酸镁 270，
氯化钠 1000，
无水磷酸二氢钠 460，
无水磷酸氢二钠 460，
碳酸氢钠 5000，
L-谷氨酰胺 1400，
L-谷氨酸钠 600，
L-一水天冬酰胺 1500，
L-天冬氨酸 700，
甘氨酸 260，
L-异亮氨酸 460，
L-亮氨酸 630，
L-甲硫氨酸 600，
L-苯丙氨酸 500，
L-缬氨酸 450，
D-泛酸钙 45，
氯化胆碱 45，
叶酸 46，
肌醇 92，
烟酰胺 48，
盐酸硫胺 45，
盐酸吡哆醇 46，
丙酮酸钠 900，
半乳糖 4500，
亚油酸 35，
胆固醇 54，
氢化可的松 31，
腐胺 29，
嵌段式聚醚F-68 46，
吐温80 58，
氢氧化钠 930，
转铁蛋白 36，
胰岛素 53，
酚红 46，
九水硝酸铁 16，
柠檬酸铵铁 67，
五水硫酸铜 9.0，
七水硫酸锌 37，
四水氯化锰 1.0，
六水氯化铬 0.1，
六水氯化钴 0.1，
五水氯化锡 0.1，
L-盐酸胱氨酸 480，
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合CHO细胞培养且能保护抗体二硫键完整性的无血清培养基II。
使用无血清培养基II，将表达抗体药物的CHO细胞以1.00×106cells/ml的密度，大于95％的活性稀释接种于荷兰Applicon公司生产的3L反应器中，进行培养。反应器参数设置为：搅拌转速—140-160转/分，pH—6.6-7.0，溶氧—20％-80％，温度—36-37度。培养14天后，采用离心加过滤的方式收集培养上清液，使用Protein-A亲和层析方式对抗体药物进行纯化收集，使用非还原CE-SDS对抗体完整性进行检测。结果如附图3和附图4所示。附图3中：■为活细胞密度曲线；▲为蛋白产量曲线；附图4中：黑色柱状图为非还原CE-SDS检测结果，包括完整抗体的含量和片段化含量。
从图3中的曲线可以得知，培养基II能够良好地支持细胞的正常生长和抗体的表达，图4表明培养基II能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，使经过一步亲测层析纯化后完整抗体的含量高于95％。
实施例3
一种适合CHO细胞培养，并有效保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键完整性、减少片段化含量的无血清培养基，包括还原性物质、中性物质和氧化性物质，各成分的含量如下，单位毫克/升：
亚硒酸钠 5，
七水硫酸亚铁 5，
L-盐酸精氨酸 100，
L-盐酸半胱氨酸 150，
L-盐酸组氨酸 140，
L-盐酸赖氨酸 250，
L-丝氨酸 150，
L-苏氨酸 200，
L-色氨酸 180，
L-脯氨酸 250，
L-酪氨酸钠盐 300，
抗坏血酸 70，
核黄素 4.5，
视黄醇 15，
生育酚 16，
葡萄糖 5500，
二硫苏糖醇 220，
硫辛酸 15，
还原型谷胱甘肽 600，
白蛋白 5，
无水氯化钙 240，
氯化钾 1000，
无水硫酸镁 180，
氯化钠 3000，
无水磷酸二氢钠 250，
无水磷酸氢二钠 260，
碳酸氢钠 3200，
L-谷氨酰胺 750，
L-谷氨酸钠 350，
L-一水天冬酰胺 850，
L-天冬氨酸 420，
甘氨酸 160，
L-异亮氨酸 250，
L-亮氨酸 350，
L-甲硫氨酸 300，
L-苯丙氨酸 280，
L-缬氨酸 240，
D-泛酸钙 20，
氯化胆碱 20，
叶酸 18，
肌醇 50，
烟酰胺 20，
盐酸硫胺 22，
盐酸吡哆醇 26，
丙酮酸钠 420，
半乳糖 2000，
亚油酸 20，
胆固醇 30，
氢化可的松 20，
腐胺 15，
嵌段式聚醚F-68 20，
吐温80 25，
氢氧化钠 480，
转铁蛋白 20，
胰岛素 22，
酚红 26，
九水硝酸铁 8，
柠檬酸铵铁 30，
五水硫酸铜 5.5，
七水硫酸锌 20，
四水氯化锰 0.5，
六水氯化铬 0.08，
六水氯化钴 0.05，
五水氯化锡 0.04，
L-盐酸胱氨酸 240。
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，简称CHO细胞)悬浮培养且能降低蛋白片段化含量的无血清培养基III。
使用该无血清培养基，将表达抗体药物的CHO细胞以1.00×106cells/ml的密度，大于95％的活性稀释接种于荷兰Applicon公司生产的3L反应器中，进行培养。反应器参数设置为：搅拌转速—140-160转/分，pH—6.6-7.0，溶氧—20％-80％，温度—36-37度。培养14天后，采用离心加过滤的方式收集培养上清液，使用Protein-A亲和层析方式对抗体药物进行纯化收集，使用非还原CE-SDS对抗体完整性进行检测。结果如附图5和附图6所示。附图5中：■为活细胞密度曲线；▲为蛋白产量曲线；附图6中：黑色柱状图为非还原CE-SDS检测结果，包括完整抗体的含量和片段化含量。
从图5中的曲线可以得知，培养基III能够良好地支持细胞的正常生长和抗体的表达，图6表明培养基III能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，使经过一步亲测层析纯化后完整抗体的含量高于95％。
对比实施例1-培养基C1
在实施例2的基础上，将部分还原性物质的含量提高至所述范围外，进行对比实施例1的验证，培养基中各物质的含量如下，单位毫克/升：
亚硒酸钠 30，
七水硫酸亚铁 55，
L-盐酸精氨酸 320，
L-盐酸半胱氨酸 442，
L-盐酸组氨酸 310，
L-盐酸赖氨酸 550，
L-苏氨酸 500，
L-酪氨酸钠盐 600
抗坏血酸 170，
核黄素 20，
生育酚 36，
二硫苏糖醇 420，
硫辛酸 32，
还原型谷胱甘肽还原型 1600，
白蛋白 40，
无水氯化钙 450，
氯化钾 1850，
无水硫酸镁 270，
氯化钠 1000，
无水磷酸二氢钠 460，
无水磷酸氢二钠 460，
碳酸氢钠 5000，
L-谷氨酰胺 1400，
L-谷氨酸钠 600，
L-一水天冬酰胺 1500，
L-天冬氨酸 700，
甘氨酸 260，
L-异亮氨酸 460，
L-亮氨酸 630，
L-甲硫氨酸 600，
L-苯丙氨酸 500，
L-缬氨酸 450，
D-泛酸钙 45，
氯化胆碱 45，
叶酸 46，
肌醇 92，
烟酰胺 48，
盐酸硫胺 45，
盐酸吡哆醇 46，
丙酮酸钠 900，
半乳糖 4500，
亚油酸 35，
胆固醇 54，
氢化可的松 31，
腐胺 29，
嵌段式聚醚F-68 46，
吐温80 58，
氢氧化钠 930，
转铁蛋白 36，
胰岛素 53，
酚红 46，
九水硝酸铁 16，
柠檬酸铵铁 67，
五水硫酸铜 9.0，
七水硫酸锌 37，
四水氯化锰 1.0，
六水氯化铬 0.1，
六水氯化钴 0.1，
五水氯化锡 0.1，
L-盐酸胱氨酸 480，
按照更改后的浓度，将各组分溶解于无热源超净水中进行配制，得到无血清培养基C1。
使用无血清培养基C1，将表达抗体药物的CHO细胞以1.00×106cells/ml的密度，大于95％的活性稀释接种于荷兰Applicon公司生产的3L反应器中，进行培养。反应器参数设置为：搅拌转速—140-160转/分，pH—6.6-7.0，溶氧—20％-80％，温度—36-37度。培养14天后，采用离心加过滤的方式收集培养上清液，使用Protein-A亲和层析方式对抗体药物进行纯化收集，使用非还原CE-SDS对抗体完整性进行检测。结果如附图7和附图8所示。附图7中：■为活细胞密度曲线；▲为蛋白产量曲线；附图8中：黑色柱状图为非还原CE-SDS检测结果，包括完整抗体的含量和片段化含量。
从图7中的曲线可以得知，培养基C1能够良好地支持细胞的正常生长和抗体的表达，图8为非还原CE-SDS检测结果，表明培养基C1不能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，抗体片段化含量较高(大于10％)。因此说明当培养基中的还原性物质含量超出本专利范围后，该无血清培养基虽然能够支持细胞的正常生长和抗体表达，但是却不能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，造成片段化含量大大提高。
对比实施例2-培养基C2
同实施例2，不同点在于，采用Sigma公司商业无血清培养基EX-Cell 302进行培养。
结果如附图9和附图10所示。附图9中：■为活细胞密度曲线；▲为蛋白产量曲线；附图10中：黑色柱状图为非还原CE-SDS检测结果，包括完整抗体的含量和片段化含量。
从图9中的曲线可以得知，培养基C2能够较好地支持细胞的正常生长和抗体的表达，图10为非还原CE-SDS检测结果，表明商业培养基C2不能够很好的保护CHO细胞培养过程中抗体二硫键的完整性，抗体片段化含量较高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。