本发明涉及一种分子生物学分析的实验方法，特别涉及一种将核酸提取及pcr扩增检测结合在一起的一体化解决方案。
背景技术：
核酸提取和pcr扩增检测是分子生物学中研究的重要实验手段，早期的实验都是纯手工完成，耗时较长、且实验结果容易受到实验人员个体操作差异的影响。随着自工业自动化的发展，在实验科学领域，传统的手工实验越来越多的被自动化设备所取代，自动化设备的可重复性及一致性减少了传统手工实验的误差，提高了实验的可靠性及实验效率。
【实验步骤】在实验步骤方面，一般的核酸分析过程基本都包括样本前处理、核酸提取和pcr扩增检测几个部分。样本前处理根据待检的样本不同，有离心、过滤、研磨等不同的处理方式，正是由于处理方式繁多，很难设计一种通用的样本前处理设备，故目前的现状在这个环节，基本都是借助离心机、温控器等通用的实验室设备半手工完成。核酸提取过程需要完成核酸的裂解及清洗纯化，常用的方法包括煮沸法、离心柱法和磁珠法等，由于磁珠法便于自动化集成，故目前自动化的核酸提取仪，采用的大多为磁珠法的核提方式。核酸提取后的样本尽管经过了洗脱浓缩，其浓度还是很低，大多还不能直接用来杂交进行后续分析，还需要经过pcr扩增放大、检测定量后再进行后面的环节。定量pcr仪即可完成pcr扩增及检测。可以看出，上述三个环节基本上都是不可或缺的。
【集成情况】需求就是发展的方向，在过往的十多年来，实现上述三个环节分立的自动化设备如样本制备仪、核酸提取仪及定量pcr仪，不断的推陈出新，占领市场。但把制备的样本加载到核酸提取仪、以及把核提后的样本加载到定量pcr仪进行扩增，这中间的转移操作环节还几乎全部需要实验人员手工完成。怎样打通这最后一个环节成为了研究的重中之重。近年来，也有厂商通过机械手、自动臂等方式替代了人手，完成了样本转移传递的工作，但几个分立设备加上机械臂的方式，使得系统及其的庞大复杂，造价极高，且一般需要批量实验运转，整个实验流程下来速度较慢。
【核酸提取情况】在核酸提取这个环节，传统的手工磁珠法实现方式使用磁力架，需要的试剂量较大，且提取过程复杂，耗时耗力。自动化的设备采用的方法大致为两种：一种是将传统手工方法自动化，在反应杯侧壁或底部设置磁性单元，通过自动化的移液装置将核酸提取过程需要的裂解液、清洗液及洗脱液逐步加入反应杯，吸排混匀后再移除废液。这种方法虽然节省了人力，实现了自动化，但在移除废液时，反应杯底部总是会残留一定的废液，导致核酸提取后的样本纯度不高。另一种是采用磁棒磁套的方法，该方法是在核酸提取的裂解、清洗和洗脱步骤中，使用磁棒及包裹在其外的磁套在不同的反应位进行移动及磁吸附，以达到核酸转移提取的目的。这种方法也实现了核酸提取的自动化，但磁套在转移过程中其上吸附的磁珠及液体容易滴落在仪器及反应杯中，会造成体系的污染。另外，采用此种方法洗脱液体积需求较大，不利于核提样本的浓缩，对于核提样本高浓度的需求不易实现。
【pcr扩增情况】一直以来，pcr的扩增时间都是以小时计算的，是分子诊断分析过程中时间最让人诟病的，要想实现分析过程的快速化，实现快检，就必须压缩pcr扩增的时间。而影响pcr扩增时间最大的因素是pcr反应体系的升降温速率。在这一点上，有人从仪器上解决，使用传导率高的如银质的传导模块；有人从试剂上解决，研究快速反应试剂、减小反应体系等；有人从耗材上解决，采用玻璃毛细管等。
【研究方向】怎样解决上面所述的三个步骤真正的自动化、减少仪器成本、压缩全流程时间、避免核酸提取过程中的污染、提高核酸提取的纯度、加速pcr扩增流程，是我们研究改进的主要方向。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种可以实现核酸提取及pcr扩增检测一体化的解决方案，其包括了样本前处理、核酸提取和pcr扩增检测等三个分子诊断分析的实验步骤。
本发明为实现上述目的，提出如下技术方案：
一种实现核酸提取及pcr扩增检测一体化的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取单元和pcr扩增检测单元。
进一步地，所述试剂盒还可以包括样本前处理单元、液体转移单元和防污染单元。
其中，所述核酸提取单元采用磁珠法的核酸提取方式，至少包括一个裂解位、清洗位和洗脱位；所述pcr扩增检测单元至少包括一个pcr位。
本发明还可以设置一个管盖位，管盖在配套仪器的管盖翻折单元的作用下实现与pcr位的紧密结合，密封pcr体系。
所述液体转移单元至少包括一个移液头和一个移液头存储位。所述样本前处理单元，包括一个样本位，还可以包括一个样本上样位，当试剂盒包括样本上样位时，所述样本上样位与样本位是联通的。所述防污染单元包括移液头内部的过滤柱、核酸提取各个位置顶端的滤液膜及pcr位内封闭体系的石蜡油。所述裂解位、清洗位、洗脱位顶部还封滤液膜。
本发明还涉及一种实现核酸提取及pcr扩增检测一体化的试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)核酸提取步骤：
a、吸取样本转移至裂解位，将样本裂解液混匀，然后进行细胞裂解，细胞裂解后游离的核酸分子与磁珠表面的硅羟基特异性结合；
b、反应一定时间后，使用移液头进行吸液操作，执行吸液操作时配套仪器的磁性单元靠近移液头外壁并提供相应的磁场，移液头内部的包被有核酸分子的磁珠在磁场的作用下靠近磁性单元附近的移液头内壁，吸液操作将裂解位内的裂解液完全吸取至移液头中，经过一定的磁吸附时间，移液头内部裂解液中的磁珠均被吸附至磁性单元一侧的移液头内壁附近，此时移液头插入裂解位，执行排液操作，裂解后的废液被排至裂解位中；
c、移液头插入清洗位的清洗液中，磁性单元远离移液头或撤除磁场，进行混匀操作，裂解后磁珠表面吸附的杂质在混匀清洗过程中逐步游离在清洗液中；
d、清洗后的内壁有磁珠体系的移液头，运动至洗脱位，磁性单元远离移液头或撤除磁场，混匀磁珠及洗脱液，进行核酸分子与磁珠的脱离过程；
e、洗脱操作完成，即核酸提取操作完成，得到纯度较高的浓缩样本；
(2)pcr扩增检测步骤：试剂盒进行pcr反应，从洗脱位吸取一定量的洗脱后样本转移至pcr位中；温控控制装置启动，提供pcr反应所需的各个阶段的温度，进行pcr反应检测，在检测阶段，检测装置依次通过各个试剂盒的pcr位，检测实时荧光信号。
进一步地，上述步骤(2)中，移液头离开pcr位后，配套仪器的管盖翻折单元将管盖位翻折，翻折后其顶端凸起与pcr位密封，保证pcr位内体系密封不挥发。
具体来说，本发明能完成所述步骤的一体化解决方案，包括液体转移单元、样本前处理单元、核酸提取单元、pcr扩增检测单元及防污染单元。为了简化系统及缩减成本，可以将上述单元集成在一个特定试剂盒上，但液体转移单元、样本前处理单元和防污染单元不是必须的，可以设置在试剂盒外、系统也可以不具备这几个单元，但含有上述单元会获得更好的用户体验和更稳定可靠的实验结果。
所述试剂盒为耗材，每个测试需要使用一个试剂盒，试剂盒内可以预先灌装试剂及预置相关的其他功能耗材，顶部可以封膜封闭体系。
所述试剂盒可以与配套仪器一起工作，系统的完成样本前处理、核酸提取及pcr扩增检测的流程。所述配套仪器至少具有活塞单元，可以配合液体转移单元完成反应液的转移、吸排液及混匀操作；所述仪器可以包括控压单元，所述控压单元与样本前处理单元配合可以完成全血分离操作。实施中控压单元可以与活塞单元集成，既能配合液体转移单元进行液体转移分配，还可以与样本前处理单元配合完成全血分离；所述仪器还应具有磁性单元，所述磁性单元可以靠近液体转移单元并提供磁场，配合反应液的吸液操作时，可以聚集磁珠；所述仪器还需具有核酸提取的温育模块和pcr反应的温育模块，其中核酸提取的温育模块可以分别提供裂解温度和洗脱温度。pcr反应的温育模块，可以提供进行快速升降温的pcr温度控制及热盖温度控制；所述仪器还应具有pcr检测单元，所述pcr检测单元至少包括一个波长荧光的检测通道，所述检测通道至少包括一激发光源和一检测器件，实施中还可以包括滤光片、镜头等。检测单元可以直线运动，对多个整列的试剂盒进行快速扫描检测。实施中所述仪器还可以具有条码扫描单元、液晶显示单元和打印机单元等，可以完成条码的自动扫描识别、实验进程的液晶显示及结果显示、实验结果打印等，具有这些单元可以提高用户体验，但不是必要的。
本发明的核心是作为耗材的一体化试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取单元和pcr扩增检测单元，还可以包括样本前处理单元、液体转移单元和防污染单元。
当所述一体化试剂盒包括液体转移单元时，所述液体转移单元至少包括一个移液头和一个移液头存储位，根据试剂体系的需求还可以包括多个移液头及多个移液头存储位。液体转移单元也可以设置在试剂盒配套的仪器中，此时配套仪器包括移液头存储位，移液头则可以由用户在实验前自主添加。所述移液头可以与配套仪器的活塞单元连接进行移液操作。连接时，移液头顶部与活塞单元的底部紧配合保证气密性，当活塞单元运动时，移液头底部尖端进入转移液体中，可以进行移液操作及混匀操作。所述移液头内部还可以包括过滤柱，过滤柱可以防止液体及挥发的气体进入活塞单元，避免造成污染。
所述样本前处理单元，可以包括一个样本位，实验前由实验人员添加处理好的样本。还可以包括一个样本上样位，当试剂盒包括样本上样位时，所述样本上样位与样本位是联通的，在联通沟道间具有能够分离血清和血浆的介质膜，该介质膜的尺寸可以过滤红细胞等大分子，配合仪器使用时，仪器的控压单元与样本上样位或样本位紧密结合，保证气密性，在正压或负压的作用下，样本上样位的全血逐步渗过介质膜，过滤后的血清通过所述联通沟道进入样本位，可用于后续核酸提取使用。
所述核酸提取单元采用磁珠法的核酸提取方式，至少包含一裂解位、一清洗位、一洗脱位。所述核酸提取单元与配套仪器的活塞单元及磁性单元配合，可以完成核酸提取流程。所述清洗位根据试剂体系的要求可以为一个或多个。配套仪器与所述裂解位、清洗位和洗脱位相连接的位置，可以设置温度控制位，根据试剂体系的需求提供裂解、清洗及洗脱所需的温度。
本发明进一步具体的操作方案如下：
使用本发明试剂盒进行核酸提取操作时，配套仪器的活塞单元连接移液头从样本位吸取一定量的前处理后样本转移至裂解位，活塞单元上下运动将样本裂解液进行吸排混匀，裂解位体系在配套仪器提供的裂解温度下进行细胞裂解，细胞裂解后游离的核酸分子与磁珠表面的硅羟基特异性结合。该裂解磁珠结合过程中，移液头可以配合活塞不间断的进行吸排操作，加速反应过程，缩减裂解时间。反应一定时间后，活塞连接移液头进行吸液操作，执行吸液操作时配套仪器的磁性单元靠近移液头外壁并提供相应的磁场，移液头内部的包被有核酸分子的磁珠在磁场的作用下靠近磁性单元附近的移液头内壁，吸液操作将裂解位内的裂解液完全吸取至移液头中，经过一定的磁吸附时间，移液头内部裂解液中的磁珠均被吸附至磁性单元一侧的移液头内壁附近，此时移液头插入裂解位，活塞单元缓慢下降执行排液操作，裂解后的废液被排至裂解位中。此时，活塞在其连接的二维或三维运动系的控制下运动至清洗位，其连接的移液头插入清洗位的清洗液中，磁性单元远离移液头或撤除磁场，活塞上下运动进行混匀操作，裂解后磁珠表面吸附的杂质在混匀清洗过程中逐步游离在清洗液中。清洗操作完成后，可以按照如上所述的磁吸附过程，将清洗混合液完全吸液至移液头中执行磁吸附操作，磁吸附后排出废液至清洗位。如试剂体系需要，清洗位可以为多个，反复执行上述清洗操作。清洗后的内壁有磁珠体系的移液头，在活塞的带动下运动至洗脱位，磁性单元远离移液头或撤除磁场，活塞上下运动反复吸排混匀磁珠及洗脱液，洗脱体系在配套仪器提供的洗脱温度下进行核酸分子与磁珠的脱离过程。一定时间后洗脱操作完成，即核酸提取操作完成，得到纯度较高的浓缩样本。此时洗脱位中还包括反应洗脱后的磁珠，为避免磁珠对后续pcr扩增检测带来影响，可以将磁珠再次进行磁吸附，将内壁吸附有磁珠的移液头转移至移液头位进行回收。
所述pcr扩增检测单元至少包括一个pcr位，还可以包括一个管盖位，所述管盖在配套仪器的管盖翻折单元的作用下可以实现与pcr位的紧密结合，密封pcr体系。所述pcr为可以为圆锥形、圆柱形等各种形状，实施中还可以为扁平的长方体结构，这种结构可以加大与配套仪器的pcr温控模块的接触面积，提高pcr体系的升降度速度，进而压缩pcr扩增时间。所述管盖位可以在配套仪器的作用下实现翻折，翻折后其顶端凸起可以与pcr位密封，保证pcr位内体系密封不挥发。
使用本发明试剂盒进行pcr反应时，配套仪器的活塞单元连接移液头从洗脱位吸取一定量的洗脱后样本穿过试剂盒顶端的滤液膜和pcr位的石蜡油密封层、转移至pcr位中，活塞单元上下运动反复吸排混匀pcr体系。移液头离开pcr位后，配套仪器的管盖翻折单元可以将管盖位翻折，翻折后其顶端凸起与pcr位密封，保证pcr位内体系密封不挥发。pcr体系准备完成后，配套仪器的pcr温控控制装置启动，提供pcr反应所需的各个阶段的温度，需要进行检测的pcr反应，在检测阶段，配套仪器的检测装置依次通过各个试剂盒的pcr位，检测实时荧光信号。所述的配套仪器检测装置一般具有光源及检测器件，需要提高光学收集效率还可以增加镜头，对于具有多光学检测通道的仪器，检测装置还可以包括滤光片等，上述的器件可以集成在一个运动装置上，通过运动装置的移动可以完成各个试剂盒pcr位的检测。
所述防污染单元可以包括移液头内部的过滤柱、核酸提取各个位置顶端的滤液膜及pcr位内封闭体系的石蜡油。防污染单元不是本发明的必要组成部分，但具有防污染单元的各项设置，会减少污染的可能性。
所述的移液头位可以预置移液头，所述的样本分离位与样本位连接处附近可以预置过滤介质膜，所述裂解位、清洗位及洗脱位可以预置核酸提取的裂解液、清洗液及洗脱液，所述pcr位可以预置进行pcr反应或定量pcr反应的体系，所述体系上可以预封石蜡油等介质封闭体系。
所述裂解位、清洗位、洗脱位顶部还可以封滤液膜，该膜可以为橡胶、硅胶等不与体系反应的软性材质，其膜表面中心可以具有十字等形状的开口，移液头可以顺利通过该开口进入相应位置进行移液操作，在移液头脱离滤液膜时，移液头底端外壁所携带的液体会被该滤液膜挂掉保留在相应位置中，不会携带出试剂盒低落在仪器或试剂盒中，减少了污染的可能性。
所述样本分离位、样本位、移液头位、裂解位、清洗位、洗脱位及pcr位顶部还可以封保护膜，该膜可以为铝塑膜等不与体系反应的易穿刺或易撕除材质。保护膜表面还可以做条码标记，条码中可以携带试剂相关信息，如检测项目、反应流程等。保护膜可以对各个位置预置的固液保持密封，还可以保证各个位置的清洁。
实施中，试剂盒可以预置及预先灌装如上所述的移液头及相关反应液，再封滤液膜，最后封保护膜。实验操作过程中，有些设置的仪器需要用户使用外置扫描枪扫码后撕掉保护膜将试剂盒加载至配套仪器中进行操作，也有些设置的仪器用户只需将试剂盒加载在配套仪器中，由配套仪器自动执行扫描条码及穿刺保护膜的操作。
本发明由于采用以上技术方案，其具有以下优点：1、实现了样本前处理、核酸提取、pcr扩增检测真正的自动化；2、结构简单、系统集成度高、耗材成本低、实验流程时间短，适用于通量不高的快速检测；3、多种手段减少了污染的可能性，保证了实验结果的有效性。
附图说明
图1是本发明一体化解决方案的示意图；
图2是本发明的液体转移单元的结构示意图；
图3是本发明防污染单元的结构示意图；
图4是本发明样本前处理单元的结构示意图；
图5是本发明核酸提取单元的结构示意图；
图6是本发明pcr扩增检测单元体系准备的结构示意图；
图7是本发明pcr扩增检测单元体系准备就绪的结构示意图；
图8是本发明pcr扩增检测单元检测时的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。
如图1和图3所示，本发明实施例由样本前处理单元1、液体转移单元2、核酸提取单元3、pcr扩增检测单元4和防污染单元5组成。上述各单元集成在一个试剂盒上，即为本实施例的一体化检测试剂盒。
本实施例的一体化试剂盒为耗材，每个试剂盒配合仪器可以进行一个完整的样本前处理、核酸提取及pcr扩增检测流程。实施例中的配套仪器具有活塞单元61(图2)，可以气密连接液体转移单元2的移液头221，进行液体转移、吸排及混匀操作。配套仪器还具有磁性单元62，其由磁性材料组成，实施例中为永磁铁。永磁铁可以提供磁场，在核酸提取过程中配合移液头221的动作可以进行磁珠吸附及转移。配套仪器还具有温控单元631、632(图5)及633(图6及图7)，可以分别对核酸提取的裂解、洗脱及pcr反应提供所需的温度。实施例中配套仪器具有管盖42翻折装置，可以在加注样本后对管盖42进行翻折操作，使管盖42的顶端凸起与pcr位41顶端紧密连接。同时，翻折装置还提供pcr反应所需的热盖温度。配套仪器还具有检测单元64(图6～图8)，可以对pcr位41进行实时荧光信号的激发及检测。实施例中检测单元64具有5光路，每个光路具有各自的激发光源641和检测器件642，不同的光路还可能具有镜头及滤色片。激发光源641和检测器件642都集成在一个运动装置64上，其可以在电机644的带动下沿直线导轨643快速扫描运动，依次对各个试剂盒的pcr位41进行光学检测。
如图2～图8所示，本发明实施例的一体化试剂盒包括样本上样位11，样本位12，移液头位211及212，移液头位211及212预置的移液头221和222，裂解位31，清洗位32-34，洗脱位35，pcr位41及管盖42。移液头221和222中预置了过滤柱51，可以防止液体或挥发的气体进入配套仪器的活塞单元61，防止了污染。其中样本上样位11中预置了可滤除红细胞等大分子的介质膜111，裂解位31预先灌装裂解液，清洗液32-34预先灌装清洗液，洗脱位35预先灌装洗脱液，pcr位41预先灌装了pcr反应体系及石蜡油52。预置固液后在裂解位31、清洗位32-34及洗脱位35压入滤液膜53，最后再将从样本上样位11到pcr位41整体进行保护膜封膜，组成了本发明可测试的一体化试剂盒。
本实施例可以进行全血样本的分离，如图2所示，如果核酸提取的样本为血浆，可以使用本发明试剂盒进行样本前处理。用户现将全血112加入样本上样位11中，配套仪器的活塞头与样本位12顶端紧密连接，保证气密性。活塞杆232在活塞缸231内向上移动，形成负压，负压使样本上样位11内的全血112逐步通过介质膜111，红细胞等大分子留存于介质膜中，过滤后的血浆113通过样本上样位11和样本位12之间的联通通道进入样本位12。至此完成了全血样本的前处理。如果核酸提取的样本为植物组织等，就需要用户在本发明仪器及试剂盒外先行完成样本前处理，将处理后的样本直接加入样本位12即可。
本发明可以进行核酸提取，如图5所示，移液头221与配套仪器的活塞单元61连接，先从样本位12中吸取一定量的前处理后样本，转移至裂解位31中(a)，活塞单元61上下运动吸排混匀体系，同时配套仪器的温育装置631工作，对裂解位31提供裂解温度。裂解过程中可通过移液头221不定时的进行吸排混匀，加速裂解反应。裂解反应时间到后，移液头221进入裂解位31，同时配套仪器的磁铁62靠近移液头221，活塞单元61连接移液头221开始吸液操作，吸液过程中进入移液头221的裂解液中的磁珠逐步被磁铁62的磁场作用吸附于移液头221的靠近磁铁62的侧壁(b)。持续保持一定时间的磁吸附后(c)，活塞单元61连接移液头221开始排液操作，裂解后的废液被排至裂解位31中(d)。此时活塞单元61和试剂盒平台组合运动，使移液头221带着磁珠体系移动至清洗位32，磁铁62远离移液头221，活塞单元61连接移液头221进行吸排液混匀操作，使吸附在磁珠表面裂解后的蛋白等杂质脱离磁珠游离于清洗液中(e)。再次进行磁吸附操作，排出清洗废液至清洗位32中。实施例中具有3个清洗位32-34，按照上述清洗流程同样操作，重复清洗保证了核酸提取的纯度。清洗后的移液头22运动至洗脱位35，磁铁24远离移液头22，活塞连接移液头22进行反复吸排混匀操作，使连接有核酸的磁珠均匀分布于洗脱液中(f)。配套仪器的温育装置632工作，对洗脱位35提供洗脱温度。反应一定时间后，核酸与磁珠分离，完成核酸提取。磁铁62靠近移液头221，执行吸液操作，洗脱液中已于核酸脱离的磁珠被吸附于移液头221靠近磁铁62的侧壁。将吸附有磁珠的移液头221回收值移液头位211中。
本实施例可以进行pcr扩增及检测，如图6至图8所示，活塞单元61连接移液头222从洗脱位吸取一定量的核酸提取后样本移动至pcr位41，移液头22穿过封闭pcr体系的石蜡油52，插入pcr体系中，执行排液操作，将核酸样本排至pcr体系中，反复吸排混匀pcr反应体系。移开移液头222后，配套仪器中的翻折装置将管盖42翻折，管盖42顶端上的凸起进入pcr位41的顶端，两者紧密配合，保证气密性，使pcr过程中体系不挥发。实施例中，pcr位41是偏平长方体结构，其与配套仪器的pcr温控位接触面较大，具有较高的升降温速度，能缩减pcr反应的时长。加入样本翻盖准备好的pcr位可以进行pcr实验，配套仪器的翻折装置同时可以也是热盖，可以提供热盖温度，配套仪器的pcr温控装置工作，提供pcr所需的各个阶段的目标温度。在扩增的检测段，检测装置64工作，沿试剂盒放置方向的平面垂直方向运动，依次通过各个试剂盒的pcr位41，并对pcr位41中的体系进行激发及荧光收集。
实验结束的试剂盒中可以按照实验要求进行废料回收，实施例配套仪器中不含管路及气路，便于维护，实现了仪器无液化操作。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。