本发明涉及天然产物提取技术领域，尤其涉及一种蓝莓花青素的提取方法。
背景技术：
蓝莓，学名越桔，属于杜鹃花科越橘属植物。蓝莓果为浆果，近圆形，呈蓝色，是少有的蓝色食物之一。研究表明，蓝莓花青素是一种强有力的抗氧化剂，具有保护人体免受自由基的损伤，增强免疫力等功效，对眼科疾病和心脑血管疾病也有较好的疗效，因此可作为一种天然色素资源应用于食品、制药和化妆品等行业。检测结果表明，蓝莓果中花青素的含量高于其他所有水果与蔬菜，排名第一，因此，蓝莓果是良好的提取天然花青素的原料。
目前花青素的提取方法有溶剂法、二氧化碳超临界萃取法、超声波法，生物复合酶法等，这些方法普遍存在提取率低、提取操作难度大或提取成本高等缺点。
据此，目前急需一种克服以上缺点，即能兼顾操作简便、提取率高、提取成本低等优点的蓝莓花青素的提取方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、提取率高，且提取成本低的蓝莓花青素的提取方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种蓝莓花青素的提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取蓝莓果，并对其表面进行除污处理；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米50-58份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至一定程度，然后将煮熟的大米分装至容器，接种米曲霉并混匀，再置于32-36℃、90％以上湿度条件下发酵3-3.5天；
取发酵3-3.5天后的大米放入容器中，再加入其质量15-18％的磷酸缓冲液，均质4-5min后，3900-4100r/min下离心6-8min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中表面除污后的蓝莓果进行液氮速冻处理，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量11-15％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，10-30min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为8-10h，酶解温度为30-40℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸，然后，用氢氧化钠调节ph至4-4.5，加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为40-70％、ph值为3-5的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以(4-8)：1的重量比例混合，加热回流提取1-2h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1-2h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于0-4℃低温下放置16-18h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在52-54℃下减压蒸发浓缩10-12h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时1-3倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用2-5倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用1-3柱体积的60-90％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在52-54℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在40-55℃真空环境中干燥。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中选取的蓝莓果具体为表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中除污处理的具体方法为：将选取的蓝莓果放置于添加有生理盐水的清洗罐中，进行蓝莓果表面除污处理，表面除污处理1-3次，每次持续3-6min。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中一定程度指电饭锅中煮至大米熟而不粘。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中米曲霉的接种量为2-4％。
作为本发明的优选方式之一，所述米曲霉的接种量具体为3％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中磷酸缓冲液的ph为6.5-7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中液氮的温度为(-30)-(-50)℃，流量为4-5m/s。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中生物复合酶溶液中，酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100iu。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)操作简便、利于产业化；
(2)对蓝莓果进行表面去污处理，避免了表面污染物对提取过程的干扰，进一步地提高了蓝莓花青素提取物的提取效率和提取纯度；
(3)米曲霉发酵大米产物中主要含有曲酸和阿魏酸，能有效抑制蓝莓中多酚氧化酶活性，利用液氮处理将蓝莓果破碎，进一步有效地降低了氧化多酚酶的活性，利于提高后续花青素的提取率；
(4)本发明利用酸性纤维素酶100iu，酸性蔗糖酶100iu和酸性单宁酶100iu作为蓝莓细胞壁的生物复合酶，其中，酸性纤维素酶可以降解蓝莓细胞壁中的纤维素成份，有助于细胞破碎；酸性蔗糖酶可以将蓝莓中含有的蔗糖成份水解为葡萄糖和果糖，从而利于花青素的提取；单宁酶可以水解蓝莓果实中含有的鞣酸和部分蛋白质，使蓝莓花青素分离纯化更加容易；三种酶相互配伍，能够显著讲解蓝莓细胞壁的组成成分，以及蓝莓中不利于花青素提取的蔗糖、单宁和蛋白质等成分，使花青素更易释放，释放更彻底；同时，利用柠檬酸溶液作为载体溶解酸性纤维素酶，酸性蔗糖酶和单宁酶，可以提高蓝莓花青素的提取效率。
综上所述，本发明的工艺步骤不仅操作简便、利于产业化，还使蓝莓细胞释放更多的花青素，极大地提高了蓝莓花青素的提取效率，既降低了工艺成本，提高了经济效益，又降低了工艺操作难度，使本发明所述的技术及工艺具有更大的可操作性和应用型。
附图说明
图1是实施例1-3中蓝莓花青素的提取方法的流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果，放置于添加有生理盐水的清洗罐中，进行蓝莓果表面除污处理，表面除污处理1次，每次持续3min；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米50份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量2％来接种米曲霉并混匀，再置于32℃、90％湿度条件下发酵3天；
取发酵3天后的大米放入容器中，再加入其质量15％的磷酸缓冲液(ph6.5)，均质4min后，3900r/min下离心6min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中表面除污后的蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-30℃，流量为4m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量11％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，10min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为8h，酶解温度为30℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节ph至4，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100iu)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为40％、ph值为3的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以4：1的重量比例混合，加热回流提取1h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于0℃低温下放置16h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在52℃下减压蒸发浓缩10h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时1倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用2倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用1柱体积的60％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在52℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在40℃真空环境中干燥。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果，放置于添加有生理盐水的清洗罐中，进行蓝莓果表面除污处理，表面除污处理3次，每次持续6min；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米58份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量4％来接种米曲霉并混匀，再置于36℃、95％湿度条件下发酵3.5天；
取发酵3.5天后的大米放入容器中，再加入其质量18％的磷酸缓冲液(ph7.5)，均质5min后，4100r/min下离心8min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中表面除污后的蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-50℃，流量为5m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量15％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，30min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为10h，酶解温度为40℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节ph至4.5，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100iu)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为70％、ph值为5的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以8：1的重量比例混合，加热回流提取2h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取2h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于4℃低温下放置18h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在54℃下减压蒸发浓缩12h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时3倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用5倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用3柱体积的90％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在54℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在55℃真空环境中干燥。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果，放置于添加有生理盐水的清洗罐中，进行蓝莓果表面除污处理，表面除污处理2次，每次持续4min；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米54份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量3％来接种米曲霉并混匀，再置于34℃、92％湿度条件下发酵3.2天；
取发酵3.2天后的大米放入容器中，再加入其质量17％的磷酸缓冲液(ph7.0)，均质4.5min后，4000r/min下离心7min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中表面除污后的蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-40℃，流量为4.5m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量13％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，20min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为9h，酶解温度为35℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节ph至4.3，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100iu)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为55％、ph值为4的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以6：1的重量比例混合，加热回流提取1.5h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1.5h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于2℃低温下放置17h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在53℃下减压蒸发浓缩11h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时2倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用4倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用2柱体积的75％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在53℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在50℃真空环境中干燥。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。