一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法。

背景技术：

CREB(cAMP response element-binding protein，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白)是一种细胞内转录因子，通过结合到环磷酸腺苷反应元件(cAMP response element，CRE)上增强下游基因的表达。CREB信号通路调控着众多生命活动，包括组织发育、记忆形成、昼夜节律等等。CREB信号通路的活性异常将导致癌症、阿尔兹海默症等疾病的发生，并最终可能导致死亡。因此，灵敏可靠地检测CREB信号通路活性，以及人为调控CREB信号通路活性，对于科学研究和临床应用都具有巨大的价值。

HTLV-1(Human T-lymphotropic virus 1，人类T细胞白血病病毒Ⅰ型)是一种C型RNA逆转录病毒，导致全球1500-2000万人感染，从而引发成年人T细胞白血病(ATL)等疾病。HTLV-1基因组的LTR(long terminal repeat，长末端重复)区域有三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。同时，HTLV-1基因组编码Tax蛋白能够激活宿主CREB信号通路以及NF-κB信号通路从而促进病毒自身存活和繁殖。因此，HTLV-1LTR区域是一个灵敏的CREB信号通路响应原件，而Tax蛋白是一个高效的CREB信号通路激活剂。

多糖是一类由碳水化合物组成的高分子生物活性物质。除了直接提供能量，很多多糖因其独特的性质而具有显著的生理功能。已有的研究表面，多糖在增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂的方面都具有理想的功效。海藻多糖是一类藻类特有的碳水化合物，因其与众不同的结构而常常具有一些特殊的生理功能。我国海藻产量丰富，居全球首位，因此也拥有了丰富的海藻多糖资源。充分利用海藻多糖将能够产生巨大的经济和社会价值，发掘海藻多糖的新生理功能具有潜在的科学意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，通过筛选克隆得到一个HTLV-1病毒LTR区域序列片段，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制，将该LTR区域序列片段构建成一个双荧光素酶报告基因载体系统，可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或抑制剂。

一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，包括萤火虫荧光素酶报告基因和HTLV-1病毒LTR区域序列片段，所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段位于萤火虫荧光素酶报告基因上游且被CREB蛋白激活后能够启动萤火虫荧光素酶报告基因表达。

所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段的序列如SEQ ID No.1所示。该序列从HTLV-1病毒基因组中克隆获得，包含三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。

所述的CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，序列如SEQ ID No.2所示。该序列包括pGL4.20[Luc2/Puro]质粒(Promega公司)的骨架，含有限制性内切酶BglII和HindIII酶切位点，通过酶切的方法将上述HTLV-1病毒LTR区域序列片段连接到pGL4.20[Luc2/Puro]质粒的BglII和HindIII之间，获得载体命名为pGL4.20-HTLV-1-LTR-2。

本发明还提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，包括以下步骤：

(1)将所述CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体和内参载体、阳性对照载体同时转染细胞后培养，所述内参载体包含可持续稳定表达的海肾荧光素酶报告基因，所述阳性对照载体包含表达产物能够激活CREB信号通路的tax基因；

(2)向细胞培养基中加入待筛选物质后继续培养；

(3)检测各细胞组的荧光素酶活性，若加入待筛选物质的细胞组荧光素酶活性比未加待筛选物质的细胞组强，则该待筛选物质为CREB信号通路激动剂；若加入待筛选物质的细胞组荧光素酶活性比未加待筛选物质的细胞组弱，则该待筛选物质为CREB信号通路抑制剂。

所述内参载体为pRL-CMV，序列如SEQ ID No.3所示。内参载体pRL-CMV购自Promega公司，包含有海肾荧光素酶报告基因，能够持续稳定地表达出海肾荧光素酶，用于作为内参消除误差。

所述阳性对照载体为pcDNA3.1-Tax，序列如SEQ ID No.4所示。该阳性对照载体为将HTLV-1基因组中的tax基因插入pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1质粒购自Promega公司)获得，HTLV-1基因组中的tax基因编码的Tax蛋白能够激活宿主CREB信号通路从而促进病毒自身存活和繁殖，由于宿主细胞自身CREB信号通路激活水平较低，所以将所述CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体导入宿主细胞内后，萤火虫荧光素酶报告基因的表达水平非常有限，不容易检测，通过再导入tax基因表达Tax蛋白，可以激活宿主CREB信号通路，从而使萤火虫荧光素酶报告基因的表达水平得到大幅度提高，便于检测，减少检测误差。

本发明还提供了岩藻多糖作为CREB信号通路抑制剂的应用。所述岩藻多糖的使用浓度为1μg/mL–1mg/mL。本发明利用上述方法筛选多种多糖，最后筛选得到岩藻多糖对CREB信号通路具有抑制作用，可以作为CREB信号通路的抑制剂。

本发明通过将HTLV-1病毒LTR区域序列片段克隆到双荧光素酶报告基因载体中，制成一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，可以用于检测CREB信号通路活性，也可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或者抑制剂。同时筛选到靶向调控CREB信号通路的岩藻多糖，岩藻多糖负调控抑制CREB通路激活。

附图说明

图1为HTLV-1LTR区域片段PCR结果电泳检测图，其中，泳道1表示DNA Marker DL2000(TaKaRa)，泳道2表示PCR产物，箭头所指表示目标片段HTLV-1基因组的LTR区。

图2为pGL4.20载体的结构示意图。

图3为载体pGL4.20-HTLV-1-LTR-2菌落PCR结果电泳检测图，其中，泳道1表示DNA Marker DL2000(TaKaRa)，泳道2-7表示单菌落的菌落PCR鉴定结果，箭头表示正确的目标片段HTLV-1基因组的LTR区(2-5正确，6-7错误)。

图4为岩藻多糖作为CREB信号通路抑制剂的筛选结果图。

图5为岩藻多糖抑制CREB信号通路特异性验证结果图。

具体实施方式

实施例1

根据GenBank中的HTLV-1的基因组序列(ID：9632565)中的LTR区采用Primer Premier5.0软件设计PCR引物，扩增引物序列如下：

上游引物FP1：5’-GCCAGATCTTGACAATGACCATGAGCCC-3’；

下游引物RP1：5’-GGCAAGCTTCTCCTGAACTGTCTCCACGC-3’。

上述引物由上海生工生物科技有限公司合成。目标片段DNA大小为353bp。

首先，进行PCR扩增，使用C8166细胞基因组(使用天根生物细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取)作为PCR扩增模板，反应体系如下，体系总体积为50μL：

反应程序为：98℃2min预变性；循环内98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；循环后72℃继续延伸3min；最后4℃保存。

PCR反应完取5μL PCR产物进行2％琼脂糖电泳分析，结果如图1所示，图中泳道1表示DNA Marker DL2000(TaKaRa)，泳道2表示PCR产物，箭头表示目标片段HTLV-1基因组的LTR区。

接着，对验证正确的PCR产物进行纯化，用两种内切酶BglII和HindIII对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为50μL：

反应程序为：在37℃酶切1h，随后进行回收纯化。

实施例2

pGL4.20[Luc2/Puro]载体(Promega公司)的结构示意图如图2所示，载体含有限制性内切酶BglII和HindIII酶切位点。用两种内切酶BglII和HindIII对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为50μL：

反应程序为：在37℃酶切1h，随后进行回收纯化。

实施例3

将实施例1和实施例2双酶切处理制备得到的目标片段DNA和载体进行连接反应，连接反应体系如下，体系总体积为10μL：

反应程序为：在16℃连接1h。

将连接产物转化入感受态细胞，对阳性克隆菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图3所示，图中泳道1表示DNA Marker DL2000(TaKaRa)，泳道2-7表示单菌落的菌落PCR鉴定结果，箭头表示正确的目标片段HTLV-1基因组的LTR区(2-5正确，6-7错误)；进一步地，对电泳检测正确的菌落进行测序验证正确，命名为pGL4.20-HTLV-1-LTR-2。

实施例4

CREB信号通路激动剂或抑制剂筛选。

筛选方法如下：

细胞(293T细胞)培养是在常规条件下进行，温度37℃，CO2浓度5％，细胞类型为293T细胞。待细胞长到对数生长期，用细胞计数板计数，按所需细胞浓度接种于96孔板，培养24h后进行细胞的转染。

取25μL OPTI-MEM培养基稀释5ng pGL4.20-HTLV-1-LTR-2，1ng pRL-CMV(购自Promega，序列如SEQ ID No.3所示)和100ng pcDNA3.1(购自Promega)空载体，25μL OPTI-MEM培养基稀释0.25μL Lipofectamine 2000试剂，5min后三者混合，共50μL，轻轻摇匀，静置20min。培养细胞每孔先吸走50μL培养基，然后再加入上述50μL混合液，最终每孔总体积100μL。每组设3个复孔。6h后再加100μL新鲜培养基，以及待筛选的指定浓度(1μg/mL–1mg/mL)天然产物。

各实验组设3个平行孔，每组实验重复3次。转染细胞分组如下：

①阴性对照组：以等量PBS代替加入的天然产物；

②阳性对照组：以等量PBS代替加入的天然产物，以pcDNA3.1-Tax(序列如SEQ ID No.4所示)阳性对照载体代替pcDNA3.1空载体；

③实验组：在②的基础上，加入指定浓度(1μg/mL–1mg/mL)天然产物。

各转染组培养24h后，消化细胞，对各组的荧光素酶活性进行检测。

荧光素酶活性检测使用双荧光素酶检测试剂盒(Invitrogen公司)，按说明书操作：首先将试剂盒的荧光素酶底物与缓冲液混合成荧光素酶试剂分装，-80℃贮存。stop&Glo缓冲液恢复至室温后与stop&Glo底物混合成stop&Glo试剂，现配现用。细胞转染48h后吸出培养基，以35μL/孔加入新鲜培养基，首先加入等量荧光素酶试剂，振荡10min，测定荧光值，再加入30μL stop&Glo试剂，振荡10min，以荧光照度计测定荧光值。

所有数据以平均值±标准差表示。统计分析采用SPSS 17.0软件，两组之间有显著差异表示为P<0.05，两组之间有极显著差异表示为P<0.01。

结果如图4所示，从荧光素酶活性检测结果我们看出，相比阴性对照组，阳性对照组CREB信号通路有约80倍的激活，而低浓度(1μg/mL)岩藻多糖(购于陕西源泰生物科技有限公司，平均相对分子量为189kDa，纯度99％)将激活抑制到62倍左右(P<0.05)，而高浓度(1mg/mL)岩藻多糖将激活抑制到50倍左右(P<0.01)，在统计学上具有显著差异。说明岩藻多糖可以作为CREB信号通路抑制剂。

实施例5

岩藻多糖抑制CREB信号通路特异性验证。

筛选方法如下：

细胞(293T细胞)培养是在常规条件下进行，温度37℃，CO2浓度5％，细胞类型为293T细胞。待细胞长到对数生长期，用细胞计数板计数，按所需细胞浓度接种于96孔板，培养24h后进行细胞的转染。

取25μL OPTI-MEM培养基稀释5ng报告基因载体(pGL4.20-HTLV-1-LTR-2或pGL4.20-NF-κB(序列如SEQ ID No.7所示))，1ng pRL-CMV和100ng pcDNA3.1-Tax，25μL OPTI-MEM培养基稀释0.25μL Lipofectamine 2000试剂，5min后三者混合，共50μL，轻轻摇匀，静置20min。培养细胞每孔先吸走50μL培养基，然后再加入上述50μL混合液，最终每孔总体积100μL。每组设3个复孔。6h后再加100μL新鲜培养基，以及1mg/mL岩藻多糖。

各实验组设3个平行孔，每组实验重复3次。转染细胞分组如下：

①报告基因载体为pGL4.20-HTLV-1-LTR-2，以等量PBS代替加入的岩藻多糖；

②在①的基础上，加入1mg/mL岩藻多糖；

③在①的基础上，将报告基因载体改为pGL4.20-NF-κB)；

④在③的基础上，加入1mg/mL岩藻多糖。

各转染组培养24h后，消化细胞，对各组的荧光素酶活性进行检测。

荧光素酶活性检测使用双荧光素酶检测试剂盒(Invitrogen公司)，按说明书操作：首先将试剂盒的荧光素酶底物与缓冲液混合成荧光素酶试剂分装，-80℃贮存。stop&Glo缓冲液恢复至室温后与stop&Glo底物混合成stop&Glo试剂，现配现用。细胞转染48h后吸出培养基，以35μL/孔加入新鲜培养基，首先加入等量荧光素酶试剂，振荡10min，测定荧光值，再加入30μL stop&Glo试剂，振荡10min，以荧光照度计测定荧光值。

所有数据以平均值±标准差表示。统计分析采用SPSS 17.0软件，两组之间有显著差异表示为P<0.05，两组之间有极显著差异表示为P<0.01。

Tax蛋白除了可以激活CREB信号通路，还能激活NF-κB信号通路。结果如图5所示，1mg/mL岩藻多糖能够显著抑制CREB信号通路激活，但对NF-κB信号通路活性没有显著效应，说明岩藻多糖是直接抑制CREB信号通路而不是通过抑制tax基因或Tax蛋白活性来间接抑制CREB信号通路。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> 人类T细胞白血病病毒Ⅰ型(Human T-lymphotropic virus 1)

<400> 1

gacaatgacc atgagcccca aatatccccc gggggcttag agcctcctag tgaaaaacat 60

ttccgagaaa cagaagtctg aaaaggtcag ggcccagact aaggctctga cgtctccccc 120

cggaggacag ctcagcaccg gctcgggcta ggccctgacg tgtccccctg aagacaaatc 180

ataagctcag acctccggga agccaccggg aaccacctat ttcctcccta tgtttgtcaa 240

gccgtcctca ggcgttgacg acaacccctc acctcaaaaa aaacttttca tggcacgcat 300

atggctcaat aaactaacag gagtctataa aagcgtggag acagttcagg ag 352

<210> 2

<211> 5743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tgacaatgac 60

catgagcccc aaatatcccc cgggggctta gagcctccta gtgaaaaaca tttccgagaa 120

acagaagtct gaaaaggtca gggcccagac taaggctctg acgtctcccc ccggaggaca 180

gctcagcacc ggctcgggct aggccctgac gtgtccccct gaagacaaat cataagctca 240

gacctccggg aagccaccgg gaaccaccta tttcctccct atgtttgtca agccgtcctc 300

aggcgttgac gacaacccct cacctcaaaa aaaacttttc atggcacgca tatggctcaa 360

taaactaaca ggagtctata aaagcgtgga gacagttcag gagaagcttg gcaatccggt 420

actgttggta aagccaccat ggaagatgcc aaaaacatta agaagggccc agcgccattc 480

tacccactcg aagacgggac cgccggcgag cagctgcaca aagccatgaa gcgctacgcc 540

ctggtgcccg gcaccatcgc ctttaccgac gcacatatcg aggtggacat tacctacgcc 600

gagtacttcg agatgagcgt tcggctggca gaagctatga agcgctatgg gctgaataca 660

aaccatcgga tcgtggtgtg cagcgagaat agcttgcagt tcttcatgcc cgtgttgggt 720

gccctgttca tcggtgtggc tgtggcccca gctaacgaca tctacaacga gcgcgagctg 780

ctgaacagca tgggcatcag ccagcccacc gtcgtattcg tgagcaagaa agggctgcaa 840

aagatcctca acgtgcaaaa gaagctaccg atcatacaaa agatcatcat catggatagc 900

aagaccgact accagggctt ccaaagcatg tacaccttcg tgacttccca tttgccaccc 960

ggcttcaacg agtacgactt cgtgcccgag agcttcgacc gggacaaaac catcgccctg 1020

atcatgaaca gtagtggcag taccggattg cccaagggcg tagccctacc gcaccgcacc 1080

gcttgtgtcc gattcagtca tgcccgcgac cccatcttcg gcaaccagat catccccgac 1140

accgctatcc tcagcgtggt gccatttcac cacggcttcg gcatgttcac cacgctgggc 1200

tacttgatct gcggctttcg ggtcgtgctc atgtaccgct tcgaggagga gctattcttg 1260

cgcagcttgc aagactataa gattcaatct gccctgctgg tgcccacact atttagcttc 1320

ttcgctaaga gcactctcat cgacaagtac gacctaagca acttgcacga gatcgccagc 1380

ggcggggcgc cgctcagcaa ggaggtaggt gaggccgtgg ccaaacgctt ccacctacca 1440

ggcatccgcc agggctacgg cctgacagaa acaaccagcg ccattctgat cacccccgaa 1500

ggggacgaca agcctggcgc agtaggcaag gtggtgccct tcttcgaggc taaggtggtg 1560

gacttggaca ccggtaagac actgggtgtg aaccagcgcg gcgagctgtg cgtccgtggc 1620

cccatgatca tgagcggcta cgttaacaac cccgaggcta caaacgctct catcgacaag 1680

gacggctggc tgcacagcgg cgacatcgcc tactgggacg aggacgagca cttcttcatc 1740

gtggaccggc tgaagagcct gatcaaatac aagggctacc aggtagcccc agccgaactg 1800

gagagcatcc tgctgcaaca ccccaacatc ttcgacgccg gggtcgccgg cctgcccgac 1860

gacgatgccg gcgagctgcc cgccgcagtc gtcgtgctgg aacacggtaa aaccatgacc 1920

gagaaggaga tcgtggacta tgtggccagc caggttacaa ccgccaagaa gctgcgcggt 1980

ggtgttgtgt tcgtggacga ggtgcctaaa ggactgaccg gcaagttgga cgcccgcaag 2040

atccgcgaga ttctcattaa ggccaagaag ggcggcaaga tcgccgtgta ataattctag 2100

agtcggggcg gccggccgct tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa 2160

accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 2220

ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt 2280

atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa 2340

tgtggtaaaa tcgataagga tccgtttgcg tattgggcgc tcttccgctg atctgcgcag 2400

caccatggcc tgaaataacc tctgaaagag gaacttggtt agctaccttc tgaggcggaa 2460

agaaccagct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 2520

gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 2580

gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 2640

cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 2700

atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat 2760

tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcgattctt 2820

ctgacactag cgccaccatg accgagtaca agcctaccgt gcgcctggcc actcgcgatg 2880

atgtgccccg cgccgtccgc actctggccg ccgctttcgc cgactacccc gctacccggc 2940

acaccgtgga ccccgaccgg cacatcgagc gtgtgacaga gttgcaggag ctgttcctga 3000

cccgcgtcgg gctggacatc ggcaaggtgt gggtagccga cgacggcgcg gccgtggccg 3060

tgtggactac ccccgagagc gttgaggccg gcgccgtgtt cgccgagatc ggcccccgaa 3120

tggccgagct gagcggcagc cgcctggccg cccagcagca aatggagggc ctgcttgccc 3180

cccatcgtcc caaggagcct gcctggtttc tggccactgt aggagtgagc cccgaccacc 3240

agggcaaggg cttgggcagc gccgtcgtgt tgcccggcgt agaggccgcc gaacgcgccg 3300

gtgtgcccgc ctttctcgaa acaagcgcac caagaaacct tccattctac gagcgcctgg 3360

gcttcaccgt gaccgccgat gtcgaggtgc ccgagggacc taggacctgg tgtatgacac 3420

gaaaacctgg cgcctaatga tctagaaccg gtcatggccg caataaaata tctttatttt 3480

cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg ttcgaactag atgctgtcga ccgatgccct 3540

tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg 3600

cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc 3660

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 3720

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 3780

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 3840

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 3900

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 3960

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4020

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4080

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4140

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 4200

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 4260

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 4320

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 4380

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 4440

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 4500

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 4560

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagcggcc gcaaatgcta aaccactgca 4620

gtggttacca gtgcttgatc agtgaggcac cgatctcagc gatctgccta tttcgttcgt 4680

ccatagtggc ctgactcccc gtcgtgtaga tcactacgat tcgtgagggc ttaccatcag 4740

gccccagcgc agcaatgatg ccgcgagagc cgcgttcacc ggcccccgat ttgtcagcaa 4800

tgaaccagcc agcagggagg gccgagcgaa gaagtggtcc tgctactttg tccgcctcca 4860

tccagtctat gagctgctgt cgtgatgcta gagtaagaag ttcgccagtg agtagtttcc 4920

gaagagttgt ggccattgct actggcatcg tggtatcacg ctcgtcgttc ggtatggctt 4980

cgttcaactc tggttcccag cggtcaagcc gggtcacatg atcacccata ttatgaagaa 5040

atgcagtcag ctccttaggg cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcggtgttgt 5100

cgctcatggt aatggcagca ctacacaatt ctcttaccgt catgccatcc gtaagatgct 5160

tttccgtgac cggcgagtac tcaaccaagt cgttttgtga gtagtgtata cggcgaccaa 5220

gctgctcttg cccggcgtct atacgggaca acaccgcgcc acatagcagt actttgaaag 5280

tgctcatcat cgggaatcgt tcttcggggc ggaaagactc aaggatcttg ccgctattga 5340

gatccagttc gatatagccc actcttgcac ccagttgatc ttcagcatct tttactttca 5400

ccagcgtttc ggggtgtgca aaaacaggca agcaaaatgc cgcaaagaag ggaatgagtg 5460

cgacacgaaa atgttggatg ctcatactcg tcctttttca atattattga agcatttatc 5520

agggttacta gtacgtctct caaggataag taagtaatat taaggtacgg gaggtattgg 5580

acaggccgca ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa 5640

tcgatagtac taacatacgc tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa 5700

taggctgtcc ccagtgcaag tgcaggtgcc agaacatttc tct 5743

<210> 3

<211> 4079

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

agatcttcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60

tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 120

atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540

gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660

taaccccgcc ccgttgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720

cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag 780

ttaaattgct aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagaag 840

ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 900

atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 960

tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaattacag 1020

ctcttaaggc tagagtactt aatacgactc actataggct agccaccatg acttcgaaag 1080

tttatgatcc agaacaaagg aaacggatga taactggtcc gcagtggtgg gccagatgta 1140

aacaaatgaa tgttcttgat tcatttatta attattatga ttcagaaaaa catgcagaaa 1200

atgctgttat ttttttacat ggtaacgcgg cctcttctta tttatggcga catgttgtgc 1260

cacatattga gccagtagcg cggtgtatta taccagacct tattggtatg ggcaaatcag 1320

gcaaatctgg taatggttct tataggttac ttgatcatta caaatatctt actgcatggt 1380

ttgaacttct taatttacca aagaagatca tttttgtcgg ccatgattgg ggtgcttgtt 1440

tggcatttca ttatagctat gagcatcaag ataagatcaa agcaatagtt cacgctgaaa 1500

gtgtagtaga tgtgattgaa tcatgggatg aatggcctga tattgaagaa gatattgcgt 1560

tgatcaaatc tgaagaagga gaaaaaatgg ttttggagaa taacttcttc gtggaaacca 1620

tgttgccatc aaaaatcatg agaaagttag aaccagaaga atttgcagca tatcttgaac 1680

cattcaaaga gaaaggtgaa gttcgtcgtc caacattatc atggcctcgt gaaatcccgt 1740

tagtaaaagg tggtaaacct gacgttgtac aaattgttag gaattataat gcttatctac 1800

gtgcaagtga tgatttacca aaaatgttta ttgaatcgga cccaggattc ttttccaatg 1860

ctattgttga aggtgccaag aagtttccta atactgaatt tgtcaaagta aaaggtcttc 1920

atttttcgca agaagatgca cctgatgaaa tgggaaaata tatcaaatcg ttcgttgagc 1980

gagttctcaa aaatgaacaa taattctaga gcggccgctt cgagcagaca tgataagata 2040

cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 2100

aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa 2160

caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag 2220

caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccaggtggca cttttcgggg 2280

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2340

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2400

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2460

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2520

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 2580

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 2640

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 2700

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 2760

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 2820

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 2880

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 2940

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 3000

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 3060

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 3120

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 3180

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 3240

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3300

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3360

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3420

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3480

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3540

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 3600

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 3660

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 3720

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 3780

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 3840

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 3900

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 3960

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 4020

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgac 4079

<210> 4

<211> 6429

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttatgg cccacttccc agggtttgga cagagtcttc ttttcggata 960

cccagtctac gtgtttggag actgtgtaca aggcgactgg tgccccatct ctgggggact 1020

atgttcggcc cgcctacatc gtcacgccct actggccacc tgtccagagc atcagatcac 1080

ctgggacccc atcgatggac gcgttatcgg ctcagctcta cagttcctta tccctcgact 1140

cccctccttc cccacccaga gaacctctaa gacccttaag gtccttaccc cgccaatcac 1200

tcatacaacc cccaacattc caccctcctt cctccaggcc atgcgcaaat actccccctt 1260

ccgaaatgga tacatggaac ccacccttgg gcagcacctc ccaaccctgt cttttccaga 1320

ccccggactc cggccccaaa acctgtacac cctctgggga ggctccgttg tctgcatgta 1380

cctctaccag ctttcccccc ccatcacctg gcccctcctg ccccatgtga ttttttgcca 1440

ccccggccag ctcggggcct tcctcaccaa tgttccctac aaacgaatag aaaaactcct 1500

ctataaaatt tcccttacca caggggccct aataattcta cccgaggact gtttgcccac 1560

cacccttttc cagcctgcta gggcacccgt cacgctgaca gcctggcaaa acggcctcct 1620

tccgttccac tcaaccctca ccactccagg ccttatttgg acatttaccg atggcacgcc 1680

tatgatttcc gggccctgcc ctaaagatgg ccagccatct ttagtactac agtcctcctc 1740

ctttatattt cacaaatttc aaaccaaggc ctaccacccc tcatttctac tctcacacgg 1800

cctcatacag tactcttcct ttcataattt gcatctccta tttgaagaat acaccaacat 1860

ccccatttct ctacttttta acgaaaaaga ggcagatgac aatgaccatg agccccaaat 1920

atcccccggg ggcttagagc ctctcagtga aaaacatttc cgtgaaacag aagtctgagc 1980

ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 2040

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 2100

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 2160

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 2220

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 2280

gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 2340

ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 2400

tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 2460

ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 2520

atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 2580

ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 2640

tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 2700

tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 2760

aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 2820

aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 2880

caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 2940

cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 3000

ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 3060

cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg 3120

atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 3180

ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 3240

cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 3300

tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 3360

tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 3420

cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 3480

catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 3540

ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 3600

ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 3660

ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 3720

tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 3780

ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 3840

atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 3900

cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac 3960

caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg 4020

ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc 4080

atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 4140

agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 4200

ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc 4260

ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 4320

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 4380

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 4440

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 4500

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 4560

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 4620

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4680

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4740

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4800

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4860

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4920

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4980

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5040

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 5100

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 5160

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggttttttt 5220

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 5280

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 5340

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 5400

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 5460

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 5520

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 5580

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 5640

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 5700

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 5760

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 5820

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 5880

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 5940

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 6000

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 6060

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 6120

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 6180

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 6240

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 6300

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 6360

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 6420

cctgacgtc 6429

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gccagatctt gacaatgacc atgagccc 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

ggcaagcttc tcctgaactg tctccacgc 29

<210> 7

<211> 5678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tagcttgggc 60

tgcaggtcga ggctggggat tcccatcctc gaggctgggg attccccatc tcgaggctgg 120

ggattcccca tctcgaggct ggggattccc catctcgacc gtccatccat tcacagcgct 180

tctataaagg cgccagctga ggcgcctact actccaaccg cgactgcagc gagcaactga 240

gaagactgga tagagccggc ggttccgcga acgagcagtg accgcgctcc cacccagctc 300

tgctctgcag ctcccaccag tgtctctcta gaggatctaa gcttggcaat ccggtactgt 360

tggtaaagcc accatggaag atgccaaaaa cattaagaag ggcccagcgc cattctaccc 420

actcgaagac gggaccgccg gcgagcagct gcacaaagcc atgaagcgct acgccctggt 480

gcccggcacc atcgccttta ccgacgcaca tatcgaggtg gacattacct acgccgagta 540

cttcgagatg agcgttcggc tggcagaagc tatgaagcgc tatgggctga atacaaacca 600

tcggatcgtg gtgtgcagcg agaatagctt gcagttcttc atgcccgtgt tgggtgccct 660

gttcatcggt gtggctgtgg ccccagctaa cgacatctac aacgagcgcg agctgctgaa 720

cagcatgggc atcagccagc ccaccgtcgt attcgtgagc aagaaagggc tgcaaaagat 780

cctcaacgtg caaaagaagc taccgatcat acaaaagatc atcatcatgg atagcaagac 840

cgactaccag ggcttccaaa gcatgtacac cttcgtgact tcccatttgc cacccggctt 900

caacgagtac gacttcgtgc ccgagagctt cgaccgggac aaaaccatcg ccctgatcat 960

gaacagtagt ggcagtaccg gattgcccaa gggcgtagcc ctaccgcacc gcaccgcttg 1020

tgtccgattc agtcatgccc gcgaccccat cttcggcaac cagatcatcc ccgacaccgc 1080

tatcctcagc gtggtgccat ttcaccacgg cttcggcatg ttcaccacgc tgggctactt 1140

gatctgcggc tttcgggtcg tgctcatgta ccgcttcgag gaggagctat tcttgcgcag 1200

cttgcaagac tataagattc aatctgccct gctggtgccc acactattta gcttcttcgc 1260

taagagcact ctcatcgaca agtacgacct aagcaacttg cacgagatcg ccagcggcgg 1320

ggcgccgctc agcaaggagg taggtgaggc cgtggccaaa cgcttccacc taccaggcat 1380

ccgccagggc tacggcctga cagaaacaac cagcgccatt ctgatcaccc ccgaagggga 1440

cgacaagcct ggcgcagtag gcaaggtggt gcccttcttc gaggctaagg tggtggactt 1500

ggacaccggt aagacactgg gtgtgaacca gcgcggcgag ctgtgcgtcc gtggccccat 1560

gatcatgagc ggctacgtta acaaccccga ggctacaaac gctctcatcg acaaggacgg 1620

ctggctgcac agcggcgaca tcgcctactg ggacgaggac gagcacttct tcatcgtgga 1680

ccggctgaag agcctgatca aatacaaggg ctaccaggta gccccagccg aactggagag 1740

catcctgctg caacacccca acatcttcga cgccggggtc gccggcctgc ccgacgacga 1800

tgccggcgag ctgcccgccg cagtcgtcgt gctggaacac ggtaaaacca tgaccgagaa 1860

ggagatcgtg gactatgtgg ccagccaggt tacaaccgcc aagaagctgc gcggtggtgt 1920

tgtgttcgtg gacgaggtgc ctaaaggact gaccggcaag ttggacgccc gcaagatccg 1980

cgagattctc attaaggcca agaagggcgg caagatcgcc gtgtaataat tctagagtcg 2040

gggcggccgg ccgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 2100

aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 2160

tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 2220

tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 2280

taaaatcgat aaggatccgt ttgcgtattg ggcgctcttc cgctgatctg cgcagcacca 2340

tggcctgaaa taacctctga aagaggaact tggttagcta ccttctgagg cggaaagaac 2400

cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 2460

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 2520

ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 2580

ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 2640

tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag 2700

aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctcga ttcttctgac 2760

actagcgcca ccatgaccga gtacaagcct accgtgcgcc tggccactcg cgatgatgtg 2820

ccccgcgccg tccgcactct ggccgccgct ttcgccgact accccgctac ccggcacacc 2880

gtggaccccg accggcacat cgagcgtgtg acagagttgc aggagctgtt cctgacccgc 2940

gtcgggctgg acatcggcaa ggtgtgggta gccgacgacg gcgcggccgt ggccgtgtgg 3000

actacccccg agagcgttga ggccggcgcc gtgttcgccg agatcggccc ccgaatggcc 3060

gagctgagcg gcagccgcct ggccgcccag cagcaaatgg agggcctgct tgccccccat 3120

cgtcccaagg agcctgcctg gtttctggcc actgtaggag tgagccccga ccaccagggc 3180

aagggcttgg gcagcgccgt cgtgttgccc ggcgtagagg ccgccgaacg cgccggtgtg 3240

cccgcctttc tcgaaacaag cgcaccaaga aaccttccat tctacgagcg cctgggcttc 3300

accgtgaccg ccgatgtcga ggtgcccgag ggacctagga cctggtgtat gacacgaaaa 3360

cctggcgcct aatgatctag aaccggtcat ggccgcaata aaatatcttt attttcatta 3420

catctgtgtg ttggtttttt gtgtgttcga actagatgct gtcgaccgat gcccttgaga 3480

gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 3540

atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct cttccgcttc 3600

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 3660

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 3720

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3780

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3840

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3900

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3960

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 4020

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 4080

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 4140

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 4200

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 4260

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 4320

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 4380

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 4440

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 4500

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag cggccgcaaa tgctaaacca ctgcagtggt 4560

taccagtgct tgatcagtga ggcaccgatc tcagcgatct gcctatttcg ttcgtccata 4620

gtggcctgac tccccgtcgt gtagatcact acgattcgtg agggcttacc atcaggcccc 4680

agcgcagcaa tgatgccgcg agagccgcgt tcaccggccc ccgatttgtc agcaatgaac 4740

cagccagcag ggagggccga gcgaagaagt ggtcctgcta ctttgtccgc ctccatccag 4800

tctatgagct gctgtcgtga tgctagagta agaagttcgc cagtgagtag tttccgaaga 4860

gttgtggcca ttgctactgg catcgtggta tcacgctcgt cgttcggtat ggcttcgttc 4920

aactctggtt cccagcggtc aagccgggtc acatgatcac ccatattatg aagaaatgca 4980

gtcagctcct tagggcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcggt gttgtcgctc 5040

atggtaatgg cagcactaca caattctctt accgtcatgc catccgtaag atgcttttcc 5100

gtgaccggcg agtactcaac caagtcgttt tgtgagtagt gtatacggcg accaagctgc 5160

tcttgcccgg cgtctatacg ggacaacacc gcgccacata gcagtacttt gaaagtgctc 5220

atcatcggga atcgttcttc ggggcggaaa gactcaagga tcttgccgct attgagatcc 5280

agttcgatat agcccactct tgcacccagt tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 5340

gtttcggggt gtgcaaaaac aggcaagcaa aatgccgcaa agaagggaat gagtgcgaca 5400

cgaaaatgtt ggatgctcat actcgtcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 5460

tactagtacg tctctcaagg ataagtaagt aatattaagg tacgggaggt attggacagg 5520

ccgcaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgat 5580

agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc 5640

tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctct 5678