本发明涉及植物基因工程
技术领域：
：。具体涉及一个影响水稻体内铜转运和分配的分子伴侣蛋白osatx1的克隆及应用。本发明包括水稻铜离子伴侣蛋白osatx1的分离、克隆、功能验证和应用。osatx1是水稻中重要的铜离子伴侣蛋白，超量表达osatx1基因导致水稻籽粒中的铜含量显著上升。因此，可望通过种植超量表达osatx1的水稻材料，增加稻米中的铜含量，进而保证农作物的营养品质。
背景技术：
：：铜(cu)是生物体生长发育所必需的微量元素之一,在生物体的生长和发育过程中发挥重要作用。铜的缺乏会危害人体健康，造成免疫缺陷(collinsandklevay,2011)。在植物体内，铜作为一种辅助因子广泛参与各种生命活动，例如：呼吸代谢中的氧化还原反应、光合作用的电子传递过程、细胞壁重建、氧化胁迫反应和乙烯保护等(maksymiec,1997；pilonetal.,2006；yruela,2009)。在缺铜时，植物表现为丛生，顶端逐渐变白等性状，通常从叶尖开始变白，严重时会降低植株的结实率(burkheadetal.,2009；huangetal.,2016)。然而，过量的铜也会对植物产生极大的毒性，例如产生高活性氧(ros)和细胞损伤等(lengetal.,2015)。因此，植株体内铜的吸收和分配必须受到严格控制。水稻(oryzasatival.)是全世界最重要的粮食作物之一。随着生活水平的不断提高，人们对水稻产量和稻米营养品质的要求也日益增加。水稻中铜离子的吸收和分配是影响水稻产量和稻米营养品质的一个重要因素。由于铜离子对植物整合肽，金属硫蛋白等具有高亲和力，细胞质中游离铜离子的量可能被限制在每个细胞少于一个离子(raeetal.,1999)。被吸收进入水稻根细胞的铜离子，一部分被隔离到液泡中，另一部分在蒸腾作用和呼吸作用的牵引下，被运输到地上部并分配到不同的器官和组织中(yamajiandma,2014；sasakietal.,2016)。但是，目前人们对水稻吸收和分配铜离子的分子机制了解的并不清楚。因此，通过转基因的方法，解析铜离子在植物体的转运和分配机制，同时保证农作物的营养品质，具有重要的意义。本发明利用水稻品种中花11(非转基因水稻)为遗传背景材料，发现超量表达编码铜离子伴侣蛋白的基因osatx1，能够显著增强铜从根向地上部的运输及其向幼嫩组织和籽粒的转移。通过提高水稻籽粒中的铜浓度，进而保证了农作物的营养品质，这为水稻的品质育种提供新的思路。技术实现要素：本发明的目的是在于克服现有技术的缺陷，提供一种影响水稻中铜转运和分配的铜离子伴侣蛋白基因及其应用。这个基因被命名为osatx1。在水稻中超量表达osatx1，发现在水稻营养生长期(4周苗龄)，野生型中花11植株根中的铜浓度为26.73mg/kgdw。超量表达阳性植株根中的铜浓度为18.4mg/kgdw，比野生型植株(非转基因水稻)减少了31.16％。野生型植株地上部的铜浓度为9.99mg/kgdw；超量表达阳性植株地上部的铜浓度为15mg/kgdw，比野生型(非转基因水稻)增加了50.15％。由此可见，超量表达osatx1显著增加了铜从根向地上部的运输。成熟期，超量表达阳性植株根中的铜浓度也显著低于野生型，而地上部较嫩的组织和籽粒中的铜浓度显著高于野生型植株。其中，野生型植株籽粒中的铜浓度为11.72mg/kgdw。超量表达阳性植株籽粒中的铜浓度是野生型(非转基因水稻)的2.55倍，有利于稻米中铜元素的积累。本发明的技术方案如下：本发明利用包含osatx1基因的dna片段作为应用的基因，进行转基因超量表达验证，将该基因转入水稻中花11，超量表达阳性植株表现出籽粒中铜积累显著增加。铜离子伴侣蛋白负责植株体内铜离子的转运和分配，对植株体内铜离子的平衡有重要意义。申请人利用拟南芥的铜离子伴侣蛋白基因atatx1的一段cdna序列，在ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blast分析，得到序列号为ap003875.3的一段编码铜离子伴侣蛋白的基因osatx1的dna序列。osatx1全长基因组的核苷酸序列为1956bp(见序列表seqidno:1)，编码81个蛋白质的氨基酸序列(见序列表seqidno:3)。该基因包括3个外显子和2个内含子。本发明是通过pcr方法，以水稻品种中花11的cdna为模板，扩增出osatx1基因的全长编码区(见seqidno：2)；利用gateway系统(gongetal.,2013)，将osatx1基因连接到目的载体(pjc034)上。再进行农杆菌介导的遗传转化，转化水稻品种中花11，得到osatx1超量表达植株。在转基因t2代植株中发现，osatx1超量表达阳性植株籽粒中的铜积累显著高于野生型植株(非转基因水稻)。本发明的优点在于：本发明分离了一种包含osatx1基因的dna片段并鉴定其功能，该片段影响水稻体内铜的转运和分配品种中花11(非转基因水稻)中，通过在水稻超量表达该编码铜离子伴侣蛋白的基因osatx1后，发现超量表达阳性植株根中的铜浓度显著低于野生型，而地上部较嫩的组织铜浓度含量显著高于野生型植株。经测试，野生型植株籽粒中的铜浓度为11.72mg/kgdw，超量表达阳性植株籽粒中的铜浓度是野生型植株的2.55倍，有利于稻米中铜元素的积累。本发明首次在水稻中超量表达一个影响水稻铜转运和分配的基因osatx1。为水稻培育优质品种提供了新的思路，。本发明克隆的基因片段可以为水稻等禾谷科作物以及其它作物的营养代谢研究提供支撑。附图说明seqidno:1是osatx1基因的全长核苷酸序列(其中碱基1-9；828-903和1796-1956的序列是该基因片段的编码区)序列长度为1956bp。seqidno:2是osatx1基因的cds序列，序列长度为246bp，编码81个蛋白质的氨基酸序列。seqidno:3是osatx1基因编码的蛋白质序列。图1：本发明的总体技术路线图。图2：osatx1基因的结构。附图标记说明：“atg”和“taa”分别是翻译起始密码和终止密码。“atg”和“taa”之间的长箭头表示osatx1基因的核苷酸区。其中，橘色标识为编码区。绿色箭头表示5和3非翻译区(untranslatedregion,utr)。图3：运用定量rt-pcr技术分析铜胁迫(缺铜或过量铜)处理后osatx1基因的表达变化。附图标记说明：图3中的a图为缺铜(2μmol杂菲二磺酸二钠盐)处理7d后osatx1基因的表达变化；图3中的b图为不同浓度铜(0.2,2,10,20和50μmol)胁迫处理7d后osatx1基因的表达变化；图3中的c图为20μmol铜胁迫处理不同时间点osatx1基因的表达变化。标准差基于三个生物学重复，每个样品为3株材料的混合样。*和**分别代表*p<0.05和**p<0.01(t检验)。图4：是本发明的遗传转化载体pm999的结构示意图。图5：融合蛋白osatx1-gfp位于水稻绿色原生质体细胞的细胞质和细胞核中。附图标记说明：利用35s:osatx1-gfp与35s:atatx1-mcherry载体共转化于水稻绿色原生质体中。atatx1-mcherry是细胞质和细胞核的一个标记。附图5中的a图显示35s:osatx1-gfp位于细胞质和细胞核；图5中的b图，显示对照35s:atatx1-mcherry位于细胞质和细胞核。附图5中的c图，与图4中的a图为同一个视野下的明场细胞。图5中的d图，为图5中的a图与b图融合状态下的细胞。标尺为10μm。图6：遗传转化超表达载体pjc034的结构示意图。图7：t2代遗传转化植株中的osatx1基因表达量。对照为水稻品种为中花11(遗传转化的受体)。超量表达植株为ox-1，ox-2和ox-3。标准差基于三个生物学重复，每个样品为3株材料的混合样。*和**分别代表*p<0.05和**p<0.01(t检验)。图8：t2代遗传转化植株中的体内的铜的含量。附图标记说明：图8中的a图和图8中的b图为水稻营养生长期的4周苗龄期植株地上部铜含量测定结果，其中图8中的a图为4周苗龄水稻植株地上部铜的含量；图8中的b图是4周苗龄水稻植株根中的铜的含量；图8中的c图为水稻成熟期籽粒中铜的含量。对照品种为水稻中花11；超量表达植株为ox-1，ox-2和ox-3。标准差基于三个生物学重复，每个样品为3株材料的混合样。*和**分别代表*p<0.05和**p<0.01(t检验)。具体实施方式以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离osatx1基因，遗传转化，以及铜元素含量的测定方法和该基因在水稻中的表达模式。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1：osatx1基因的序列和结构分析osatx1基因结构的预测：本发明的申请人利用拟南芥的铜离子伴侣蛋白基因atatx1的一段cdna序列，用blast方法检索核苷酸数据库genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，发现该cdna序列与来自水稻品种日本晴的一条位于水稻8号染色体、长126112bp序列(genbank注册号：ap003875.3)中的一段(第16242至18197处)高度同源。在水稻基因组数据库tigr(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，这片段与atatx1基因同源的水稻序列被注释为一个基因，其编号是loc_os08g10480。申请人将这个基因命名为osatx1基因(antioxidantprotein1)。osatx1全长基因组序列为1956bp，编码81个氨基酸。该基因包括3个外显子和2个内含子(见图2，其核苷酸徐序列和编码区见seqidno:2所示)。1、从水稻品种“中花11”中分离、克隆osatx1基因中花11(zh11)是本领域中常用的一个水稻品种。申请人根据osatx1基因在粳稻“日本晴”基因组中的位置和结构(水稻基因组数据库tigr)，以osatx1基因两侧的基因组序列为模板，设计了两条pcr引物即：osatx1-oxf(5′-aaaaagcaggcttaatggctgagactgttgtgctc-3′)(下划线代表attb1位点)和osatx1-oxr(5′-agaaagctgggtattccactgggaaattgttacatc-3′)(下划线代表attb2位点)，从中花11中扩增得到包含osatx1基因、长度为330bp的dna片段，它包括完整的osatx1基因序列。2、osatx1基因的结构分析为了获得osatx1基因全长cdna序列，申请人提取水稻品种中花11的总rna。具体步骤为：取3～5g总rna用dnasei(美国invitrogen公司)处理15min以去除基因组dna污染，然后参照zhou等(2002)报道的方法，使用oligo(dt)15寡聚引物和m-mlv反转录酶(美国promega公司)进行反转录成cdna。然后利用pcr引物osatx1-f和osatx1-r，以总cdna为模板，扩增出osatx1基因的全长cdna。对pcr产物进行测序分析，获得osatx1基因的cdna序列。比较分析osatx1基因的基因组序列和cdna序列，确定osatx1基因由1956个核苷酸组成，仅包含3个外显子，2个含子(图2)。osatx1基因的cdna序列由246个核苷酸组成(位于序列表seqidno：1的1－9bp，828－903bp，1796－1956bp处)，共编码81个氨基酸。3、osatx1基因的编码产物分析用blastp(altschul等，1997)报道的方法分析，osatx1蛋白质与拟南芥的铜离子伴侣蛋白atatx1的氨基酸序列相似性为87％。实施例2：铜胁迫处理后osatx1基因的表达分析为了验证osatx1基因是否参于水稻铜吸收转运的调控，本发明首先采用定量pcr(quantitativereal-timepcr,qrt-pcr)技术分析了osatx1基因对铜胁迫处理的反应。本发明采用营养液培养的方法种植水稻。营养液培养液采用标准配方。标准营养液培养液中铜盐(硫酸铜)含量为0.12μmol。在缺铜胁迫处理实验中，培养液中加入铜离子螯合剂杂菲二磺酸二钠盐(bcs)，杂菲二磺酸二钠盐处理浓度为2μmol。在铜过量胁迫处理实验中，培养液中铜的处理浓度为20μmol。将水稻品种中花11营养液培养至4叶期开始进行铜胁迫处理。铜胁迫处理后在不同时间点分别取水稻苗(shoot)和根，抽提总rna并进行反转录。具体步骤：取3～5g总rna用dnasei(美国invitrogen公司)处理15min以去除基因组dna污染，使用oligo(dt)15寡聚引物和m-mlv反转录酶(美国promega公司)进行反转录。采用实时定量pcr分析试剂盒greenpcrmastermix(购自宝生物工程大连有限公司)，根据试剂盒的使用说明书操作，在abi7500real-timepcrsystem仪器(美国appliedbiosystems公司)上进行实时定量pcr反应。使用相对定量方法量化基因表达(livakandschmittgen,2001)。用水稻泛素(ubiquitin,ubi)基因的表达量衡量、并均一化样品rna含量。qrt-pcr分析中的osatx1基因特异pcr引物是osatx1-qf(5′-ttacaccagatgccgttcttc-3′)和osatx1-qr(5′-agcagcagtagcttcaacag-3′)，玉米泛素基因pcr引物是ubi-f(5′-aaccagctgaggcccaaga-3′)和ubi-r(5′-acgattgatttaaccagtccatga-3′)。定量rt-pcr分析显示，在高浓度铜的处理下，osatx1基因受到诱导表达。这提示osatx1基因可能参与铜吸收转运的调控，结果见图3。实施例3：osatx1基因编码产物亚细胞定位分析1、osatx1亚细胞定位瞬时表达载体的构建本发明所用的农杆菌介导的遗传转化载体是pm999(结构见图4)。它携带camv35s启动子和绿色荧光蛋白基因(gfp)标签。以全长osatx1基因克隆为模板，采用pcr技术扩增osatx1基因的编码区段dna。pcr引物为osatx1-scf(5′-cggaattcatggctgagactgttgtgctc-3′)(下划线代表ecor1限制性内切酶消化位点)和osatx1-scf(5′-ggggtaccttaagatgaagcagcagtagcttc-3′)(下划线代表kpni限制性内切酶消化位点)。将pcr产物与t-a克隆载体pgem-t(购自美国promega公司)连接，将连接好的载体进行电转化(电转化仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压为1800v，具体操作参考该仪器的使用说明书)进入大肠杆菌，通过酶切筛选阳性克隆，再经测序验证有无碱基突变。用限制性内切酶ecor1和kpni消化带有osatx1基因的编码区的阳性克隆和pm999载体。用酶切纯化好的包含osatx1基因编码区的dna片段和酶切好的载体做连接反应。通过ecor1和kpni酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆(图4)。2、水稻绿色原生质体的分离，转化与亚细胞定位分析将中花11种子按照常规的植物组织培养和遗传转化方法于生根培养基中发芽，28℃光照培养10-15d。水稻绿色原生质体的分离和转化主要是在前人报道的方法基础上进行优化(xieandyang,2013)。试剂和仪器：(1)qiagenplasmidmidikit(catno.12143)纯化的质粒。配制以下母液：(1)0.8molmannitiol(sigmam1902,fw:182.17)：7.287g加灭菌ddh2o，定容到50ml，于55℃水浴溶解。(2)0.6molmannitiol(sigmam1902,fw:182.17)：2.186g加灭菌ddh2o，定容到20ml，于55℃水浴溶解。或者直接用0.8molmannitiol稀释。(3)0.2molkcl(sigmap5405,fw:74.55)：0.746g加灭菌ddh2o，定容到50ml。(4)1molcacl2·2h2o(sigmac7902,fw:147.01)：7.35g加灭菌ddh2o，定容到50ml。(5)0.5molmgcl2·6h2o(sigmam2393,fw:203.3)：5.083g加灭菌ddh2o，定容到50ml。(6)1.54molnacl(sigmas6191,fw:58.44)：4.5g加灭菌ddh2o，定容到50ml。(7)0.1molmes-koh,ph5.7:meshydrate(sigmam8250,fw:195.24)：0.195g加灭菌ddh2o,～150μlkoh(sigmap5958)调至ph5.7，koh约为2mol,定容到10ml。其他试剂和仪器：本发明使用下述仪器设备：cellulosers(yakulthonsha)；macerozymer10(yakulthonsha)；bsa(sigmab4287)；β-mercaptoethanol(sigmam3148)；peg4000(sigma81240)；fetalbovineserum(gibcobylifetechnologies,10099-133)；可调加减速度的吊篮式冷冻离心机；2ml圆底离心管(eppendorf0030123.344)和50ml圆底离心管(beckman357006)。2、操作步骤：配制酶解液，现配现用：表1酶解液的配制方法具体操作步骤：(1)准备酶解液，取出15棵10-15天幼苗，于滤纸上切成小于0.5mm片段，及时转入0.6molmannitol中。(2)待所有幼苗切完后，于0.6molmannitol中平衡10min。酶解液降至室温，加入后续试剂。吸去甘露醇溶液，加入室温酶解液。置于真空箱中30min，置于室温，50rpm酶解3.5h。(3)准备peg-cacl2·2h2o溶液，配制1ml，成分如表2所示。表2peg-cacl2·2h2o溶液的成分(4)酶解将近完成时，配制w5和mmg溶液，成分见表3和表4。表3w5溶液的成分表4mmg溶液的成分(5)酶解完成后，加入10mlw5后，在水平摇床上以80rpm速度释放原生质体，释放10min。(6)100g,室温下离心过滤液7min，加速减速设置为slow。慢慢吸取上清液，勿将所有上清液吸去。(7)加入约3mlw5悬浮原生质体，轻轻晃动离心管以摇散原生质体。吸取10μl原生质体悬浮液镜检，调整原生质体浓度到0.5-1x107/ml，置原生质体悬浮液于暗处，室温保存60min。准备转化用的质粒。(8)在离心机，100g,室温下离心7min，弃去上清。将原生质体悬浮于mmg溶液中，并将浓度调整到0.5-1x107/ml。(9)将5μg质粒稀释至10μl，加入100μl原生质体悬浮液。轻摇混匀后，加入110μlpeg-cacl2溶液，轻弹混匀。28℃，黑暗中转化10-15min。(10)加入440μlw5溶液，上下颠倒以停止转化。(11)在离心机，100g,室温下离心7min，期间，用5％小牛血清处理24孔细胞培养板。弃去上清，加入400μlwi溶液，重悬原生质体，并将其转移到细胞培养板中。培养板中预先加入400μlwi溶液。(11)室温培养12-16h，收集原生质体。表6wi溶液的成分(12)室温下培养12-16h，收集原生质体。(13)在激光共聚焦显微镜下观察gfp的表达。结果表明，osatx1-gfp与拟南芥atatx1-mcherry共定位于细胞质和细胞核(图5)。实施例4：超量表达osatx1基因验证其在水稻铜吸收转运中的功能1.超量表达遗传转化载体的构建本发明所用载体为pjc034(本实验改造的载体，能用于基因的超表达，载体图谱见图6)。该载体携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素基因启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。申请人将osatx1基因的pcr产物与供体载体pdonr207(购自invitrogen公司)混合，加入bp重组混合酶进行重组反应，即可转化并得到带有目的基因的入门载体。然后在得到的入门载体的克隆中，利用lr酶将目的基因再重组到目标载体pjc034上(gongetal.,2013)。2.遗传转化和t0代遗传转化植株的分析通过农杆菌(eha105由澳大利亚cambia实验室提供，参见：newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants，1993，transgenicres2:208-218)介导和水稻遗传转化体系，将正确克隆的质粒导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织、再进行分化、生根、炼苗和移栽等步骤，得到转基因植株。农杆菌(eha105)介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要是在hiei等人报道的方法基础上进行优化(livakandschmittgen,2001)。本发明共获得独立转化植株80株。采用实时定量pcr分析检测基因在植物体内的表达量。将得到的超量表达植株进行繁殖，得到t1和t2代转基因植株。结果显示，与对照野生型(非转基因水稻)中花11相比，阳性转化植株体内的osatx1基因的表达量获得大幅度提高(图7)。3.超量表达植株中铜含量的分析为验证遗传转化植株是否能够增强对铜吸收和累积的能力，本发明对在t0代表达量显著提高的3个遗传转化植株(编号为osatx1.ox-1,osatx1.ox-2和osatx1.ox-3)的t2代转基因阳性家系进行了铜含量的分析。在不同生育期(4周苗龄，抽穗期和成熟期)对各个组织进行取样和铜元素含量测定分析。铜含量测定方法主要在已报道的方法上进行优化(yangetal.,2013；yangetal.,2014)。结果显示，超量表达osatx1基因的植株地上部较嫩的组织和籽粒中的铜浓度都显著提高(参见图8)。在水稻营养生长期(4周苗龄)，野生型中花11(非转基因水稻)植株地上部的铜浓度为9.99mg/kgdw，超量表达阳性转基因植株地上部的铜浓度为15mg/kgdw，比野生型中花11植株地上部的铜浓度增加了50.15％(图8中的a图)。而野生型植株根中的铜浓度为26.73mg/kgdw。超量表达阳性转基因植株根中的铜浓度为18.4mg/kgdw，比野生型减少了31.16％(图8中的b图)。这些结果证明，超量表达osatx1基因可以促进水稻将根中吸收的铜离子向地上部运输。而在成熟期，超量表达阳性转基因植株根中的铜浓度也显著低于野生型，而地上部较嫩的组织和籽粒中的铜浓度则显著高于野生型中花11植株。其中，野生型中花11植株籽粒中的铜浓度为11.72mg/kgdw，超量表达阳性转基因植株籽粒中的铜浓度为野生型中花11植株的2.55倍(图8中的c图)，该结果有利于稻米中铜元素的积累。附录：相关试剂及其配制方法：65％hno3：sigma-aldrich，usa，cas：30709；去离子水：millipore18.2mω超纯水；外标准液：agilentenvironmentalcalibrationstandard，usa，cas：5183-4688；内标准液：agilenticp-msinternalstdmix，usa，cas：5188-6525；调谐液：agilenttuningsolutionforicp-ms7500cs，usa，cas：5185-5959；灌木枝叶成分分析标准物质：中华人民共和国，gbw07602(gsv-1)。仪器：微波消解仪：cemmars6，usa；电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)：agilent7700seriesicp-ms，usa；微波消解和铜元素含量测定操作步骤：(1)将样品放在在80℃烘箱中烘3d，至恒重；然后用组织粉碎机将样品研磨成细粉。(2)称样：称取0.2g(精确至0.0001g)烘至恒重的植物组织粉末样品，倒入微波消解內衬管底部，注意不要粘在管口。(3)消解：加入10ml65％hno3，放上弹片，盖紧盖子，按顺序依次放入消解管架，摆满后放入微波消解仪mars6微波腔内，关紧腔门，调出相应消解程序核对无误后运行。(4)赶酸：待微波消解程序运行完毕，温度降至80℃以下时，取出样品，于通风橱中拧开盖子160℃赶酸40min。(4)定容：待赶酸仪温度降至室温时，将样品定容到50ml，混匀后放置澄清后即可上机测定(icp-ms)。参考文献1.burkheadjl,reynoldska,abdel-ghanyse,cohucm,pilonm(2009)copperhomeostasis.newphytol182:799-816；2.collinsjf,klevaylm(2011)copper.advnutr2:520-522；3.gongl,chenw,gaoy,liux,zhangh,xuc,yus,zhangq,luoj(2013)geneticanalysisofthemetabolomeexemplifiedusingaricepopulation.procnatlacadsciusa110:20320-20325；4.huangxy,dengf,yamajin,pinsonsr,fujii-kashinom,dankuj,douglasa,guerinotml,saltde,majf(2016)aheavymetalp-typeatpaseoshma4preventscopperaccumulationinricegrain.natcommun7:12138；5.lengx,muq,wangx,lix,zhux,shangguanl,fangj(2015)transporters,chaperones,andp-typeatpasescontrollinggrapevinecopperhomeostasis.functintegrgenomics15:673-684；6.livakkj,schmittgentd(2001)analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2(-deltadeltac(t))method.methods25:402-408；7.maksymiecw(1997)effectofcopperoncellularprocessesinhigherplants.photosynthetica34:321-342；8.pilonm,abdel-ghanyse,cohucm,gogolinka,yeh(2006)coppercofactordeliveryinplantcells.curropinplantbiol9:256-263；9.raetd,schmidtpj,pufahlra,culottavc,o'hallorantv(1999)undetectableintracellularfreecopper:therequirementofacopperchaperoneforsuperoxidedismutase.science284:805-80810.sasakia,yamajin,majf(2016)transportersinvolvedinmineralnutrientuptakeinrice.jexpbot67:3645-3653；11.xiek,yangy(2013)rna-guidedgenomeeditinginplantsusingacrispr-cassystem.molplant6:1975-1983；12.yamajin,majf(2014)thenode,ahubformineralnutrientdistributioningraminaceousplants.trendsplantsci19:556-563；13.yangm,zhangw,donghx,zhangyy,lvk,wangdj,lianxm(2013)osnramp3isavascularbundles-specificmanganesetransporterthatisresponsibleformanganesedistributioninrice.plosone8；14.yangm,zhangy,zhangl,huj,zhangx,luk,dongh,wangd,zhaofj,huangcf,etal(2014)osnramp5contributestomanganesetranslocationanddistributioninriceshoots.jexpbot65:4849-4861；15.yruelai(2009)copperinplants:acquisition,transportandinteractions.functplantbiol39:409-430；16.gongl,chenw,gaoy,liux,zhangh,xuc,yus,zhangq,luoj(2013)geneticanalysisofthemetabolomeexemplifiedusingaricepopulation.procnatlacadsciusa110:20320-20325。序列表<110>华中农业大学<120>影响水稻体内铜转运和分配的分子伴侣蛋白osatx1的克隆及应用<141>2018-06-10<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1956<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<220><221>gene<222>(1)..(1956)<400>1atggctgaggtacggccccgcgacagaactccttgtttattcgtttggtgttaggggcgc60ggtcccttcctgcggtcctggagagagaagagagagagagagagagagagagagagagag120agagagagagagagagagaggagagggttgatcgataggggtagatggggaggccaagag180aggaggattcctcttttttttttttggcgtcgagttgtttgaatatgggggaagaagcgt240gttcttttagcttgcgtgtggggttaattagggatctgattatgatctgatgattggccg300gcgcgctgatcgatcagcttgcttgttcttgcgcgtgcttgtcttggctttccttcatcg360tgcttgcaggccagggtatgacttggggatgatgttttgggcgaaatcttgctaggaggg420cggtatacctttcagagtttcagtagttcaaacaccaactgatggacaagttttagaact480tcatggtgggggtcgaaactagcttgatgattttgatttgtgtacgttcttgttgaaacg540agtacagattgcggagtaggcccgattggatagttgttgtacctaccttaaatgagccat600cttgttggttatggtctgtgagttcaatgatagagcatgattgtccccatctgattatta660ctagttcccttccagaatgaagcataaattcatttaattgttgtcggttacagtaaatct720tgattgggaattatgatgtattccgagtaccatgtggcgtgtgcgaagatgtgattgagg780acgaatgaggacttagctgatccttgctatttttgtctattgtgcagactgttgtgctca840gggttgggatgtcctgtgaaggttgtgttggagctgttaagcgggtactgggaaagatgc900aaggttagtttagctctgtcctcagcgttctgtttgttgagaactttttcctttttgcga960gcaatttttacaatgtaacgcgtgcaatgcaacattggacttaacttatgccaatgctga1020atctgaaccaatcctggtatatctctgcaattggtatctcctctttaaaaattcccttaa1080ctgtatgcttttgacgaacactggataattttgattgggtgaaatcttgtgcaatttcta1140gtttcaaattgtacctgcgtctgatttctaggcataaagatattgttttgtaatattgct1200ttcgattgtattttggactcatactttggcaattatgtacctttctgtcactaccatgac1260actcaccacttgtgtaagtggcaatgtccatagacaaaaggaaattaaggtatccggagt1320gcagacgcaaacaagttaggcaacaactttagtattcaaatgagaatttatagctgtatt1380tgcttgttttgctggtattataaataaaattttgagctctgttgttaatgattgctattt1440gaaattatccacaactatagagtatagtgggcaaacatataatttcgaatttctctcctg1500catgctatttataaattcaattaatttttaatcaaattgaaagaatggttggtaaaaagg1560aaaactacatgtgcttcatctttggcacattttggtccaaggcagttgcttgaataatgc1620taaggctatctttcaaacccaacctctgcaatcagccctaatgacttccaatattctgca1680ttagatcatggaagcacaaatgattatttatacttgcatatgtattcttgtaagtgtcac1740tgcaatatttagcgcatcgatctaaacatctgagttggacttgtggttgcttcaggagtg1800gagtcctttgacgtagacatcaaggagcagaaggtcactgtcaagggaaatgttacacca1860gatgccgttcttcagaccgtttcaaagacgggcaagaagacctcgttctgggatgctgag1920cctgcacctgttgaagctactgctgcttcatcttaa1956<210>2<211>246<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<220><221>gene<222>(1)..(246)<220><221>cds<222>(1)..(246)<400>2atggctgagactgttgtgctcagggttgggatgtcctgtgaaggttgt48metalagluthrvalvalleuargvalglymetsercysgluglycys151015gttggagctgttaagcgggtactgggaaagatgcaaggagtggagtcc96valglyalavallysargvalleuglylysmetglnglyvalgluser202530tttgacgtagacatcaaggagcagaaggtcactgtcaagggaaatgtt144pheaspvalaspilelysgluglnlysvalthrvallysglyasnval354045acaccagatgccgttcttcagaccgtttcaaagacgggcaagaagacc192thrproaspalavalleuglnthrvalserlysthrglylyslysthr505560tcgttctgggatgctgagcctgcacctgttgaagctactgctgcttca240serphetrpaspalagluproalaprovalglualathralaalaser65707580tcttaa246ser<210>3<211>81<212>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