OsSN28基因在控制水稻耐高温中的应用的制作方法

本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高高温耐受能力的水稻ossn28基因在水稻耐高温遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选的方法，通过反向遗传学手段，克隆到控制水稻耐高温应答基因ossn28，高温胁迫表型鉴定结果表明，超表达ossn28基因可以提高水稻在极端高温环境下的花粉育性与结实率，而ossn28基因的缺失则会导致水稻花器官对高温超敏感，证实了该基因的功能及应用途径。

背景技术：

非生物逆境(如干旱、涝害、高温、低温、盐碱等)严重制约着植物的生长发育和作物的生产增收，水稻是世界上主要的粮食作物之一，研究水稻对非生物逆境的适应和抵抗机制，将有助于对其进行抗逆遗传改良，扩大种植范围、提高产量。为了适应各种环境变化，在逆境中生存下来，植物在长期的进化过程中形成了一系列复杂的逆境应答调控机制，通过对环境胁迫信号的感知、传递和应答反应，在分子水平、细胞水平和植株水平上发生一系列变化，产生相应的耐受机制或适应性，从而最大限度地降低胁迫带来的伤害，维持基本的生理活动(xiong等，cellsignalingduringcold,droughtandsaltstress.plantcell.14(suppl),s165–s183，2002)。功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达，受到了调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。大多数类型的转录因子都参与了植物的非生物逆境应答反应，包括ap2/erebp、bzip、hd-zip、myb、myc、nac和zincfinger类转录因子(yamaguchi-shinozakik,shinozakik.transcriptionalregulatorynetworksincellularresponsesandtolerancetodehydrationandcoldstresses.annurevplantbiol,2006,57:781-803)。通过基因工程，部分逆境应答转录因子已经成功应用于水稻抗逆遗传育种。其中，nac(nam,atafandcuc)是一植物当中特有的一类转录因子，其中部分成员，如snac1和snac3等在水稻中超量表达后能显著提高转基因植株对高温、干旱等非生物逆境的抗性(hu等.overexpressinganam,ataf,andcuc(nac)transcriptionfactorenhancesdroughtresistanceandsalttoleranceinrice.procnatlacadsciusa,2006,103:12987-12992.和fang等.astress-responsivenactranscriptionfactorsnac3confersheatanddroughttolerancethroughmodulationofreactiveoxygenspeciesinrice.jexpbot,2015,21:6803-6817)。

水稻是重要的粮食作物和模式植物，其花器官的发育以及扬花和授粉过程对环境温度极为敏感，在全球气候变暖现象日益显著的今天，培育抗高温能力增强的水稻具有重要的意义。在我们的前期研究中通过反向遗传学手段筛选在抽穗期对高温环境敏感的水稻突变体，成功克隆鉴定到一个对水稻抽穗期高温应答具有显著调控作用的nac转录因子基因ossn28。鉴于超量表达ossn28的转基因水稻植株在高温环境下结实率以及产量相对阴性对照显著提高，对ossn28进行进一步的功能研究，鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是利用水稻nac转录因子基因ossn28水稻的高温抗性。本发明分离和应用一种包含ossn28基因的dna片段，缺失该片段时，水稻抗高温胁迫能力减弱，而利用组成型启动子驱动该片段超量转录ossn28基因后，水稻对高温胁迫耐受力增强。

所述的ossn28基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，序列长度为1862bp，该基因编码的蛋白质的序列如seqidno：2所示，编码252个氨基酸残基。

可以采用pcr技术，从水稻基因组dna和由mrna反转录而得的cdna中扩增得到本发明的ossn28基因，可将这一序列构建到pcambia1031u等基因超量表达载体上，通过转化水稻植株，可通过提高该基因的表达量，从而获得对高温耐受能力增强的转基因水稻植株。

携带有本发明ossn28基因的表达载体可通过使用ti质粒，植物病毒载体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998,methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition)。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明分离的ossn28基因的全序列(1-1862bp)，其中66-239碱基位和972-1556碱基位是外显子(exon)序列。

序列表seqidno:2是本发明分离的ossn28基因的编码区(cds)序列(1-759bp)及其对应的氨基酸序列(1-759bp)，编码252个氨基酸残基。

序列表seqidno:3是本发明的ossn28基因编码的蛋白质的序列，编码252个氨基酸残基的蛋白质序列。

图1：采用clustalω软件(公开使用软件)将ossn28基因预测的蛋白序列与水稻和拟南芥中部分逆境响应相关的nac转录因子蛋白序列进行比对的结果。附图标记说明：

sn28:xp_015625739.1sequencesource:oryzasativa水稻；

snac1:xp_015630558.1,sequencesource:oryzasativa水稻；

snac2:xp_015620920.1,sequencesource:oryzasativa水稻；

rd26:np_001078452,sequencesource:arabidopsisthaliana拟南芥；

ataf1:np_171677,sequencesource:arabidopsisthaliana拟南芥；

tanac69:aau08785,sequencesource:triticumaestivum小麦。

图2：利用real-timepcr检测ossn28在多种逆境(干旱、高温、低温、脱落酸即aba等)胁迫后的表达量变化，除高温使用穗部以外，其他样品均为四叶期叶片。附图标记说明：ossn28基因相对表达量以处理前(0时间)为参照(即设定为1)，结果为三次重复，误差线代表标准偏差(sd)。

图3：ossn28基因的组织表达谱分析。附图标记说明：calli为继代培养的愈伤组织；embryo为当年收获的种子的胚器官；root和shoot分别为生根培养基中生长的四叶期幼苗的根和地上绿色部分；nternode为分蘖期茎秆；leafl2和flagleaf分别为抽穗期的倒二叶和剑叶，collar为剑叶的叶枕；flagleafsheath为剑叶的叶鞘；三个panicle样品分别为不同长度(发育时期)的穗子；huff、pistil、anther分别为抽穗后的颖花的颖壳；雌蕊和雄蕊。检测结果基于三次重复，误差线表示标准偏差(sd)。

图4：ossn28基因超表达材料(sn28-oe)及ossn28t-dna插入突变材料(sn28m)中的ossn28基因转录水平检测。附图标记说明：图4中的a图为实时定量pcr(real-timepcr)检测两个独立sn28-oe家系(oe-25和oe-27)以及由其t0代分离而得的转基因阴性材料(oeck)中ossn28基因转录水平的结果，水稻ubiquitin1基因作为内参基因，纵坐标数值表示sn28-oe中ossn28的表达量相对于oeck中ossn28的表达量的倍数，结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(sd)。图4中的b图为使用反转录pcr(rt-pcr)检测sn28m纯合突变体以及由其杂合个体分离而得的阴性对照材料(mck)中ossn28基因转录水平的结果，水稻actin1基因作为内参基因。

图5：sn28突变体植株花器官对高温胁迫耐受力降低。附图标记说明：图5中的a图展示正常情况下与高温处理后sn28m纯合突变体与阴性对照mck的扬花期花药形态(注意sn28m在高温处理后花药弯曲变形，而mck为正常的柱状且能正常开裂散粉)。图5中的b图为正常情况下与高温处理后sn28m与mck的花粉碘染育性检测结果，可见高温处理后sn28m中不可育花粉的比例显著高于mck。图5中的c图为sn28m与mck在正常情况与高温处理后授粉效果检测，可见高温处理后，mck柱头上的可萌发花粉明显多于sn28m。图5中的d图显示极端高温处理的孕穗期材料穗抽出且完成结实后的表型，sn28m穗子完全不育且下部颖花(处理时相对上部发育时期较早)出现发白死亡的情况，而mck虽然结实率大幅下降，但仍能结实且颖花基本没有死亡的情况。

图6：sn28-oe植株对高温胁迫耐受力提高。附图标记说明：图6中的a图和图6中的b图分别为高温处理下sn28-oe家系oe-25与阴性对照oeck的花粉碘染育性检测与柱头授粉效果观测结果，高温下sn28-oe材料的可育花粉更多。图6中的c图展示高温处理后oe-25、oe-27和oeck的结实情况，可见sn28-oe材料的结实率显著高于阴性对照。图6中的d图为夏季自然高温胁迫后oe-25、oe-27和oeck的解释情况。图6中的e图为2016年8月(高温)和2014年8月(正常)的气温测量结果，横坐标是从8月1日开始的日期，*号标注为材料的抽穗日期。图6中的f图为水田中自然高温胁迫后相关材料的结实率与有效穗率比(即实粒数大于5粒的穗数在总穗数中的比例)的统计结果，箱线图误差线表示极值范围，下箱线代表1/4分位数，中线代表中位数，上箱线代表3/4分位数，每一测量值由圆点标出，oe-25、oe-27、oeck分别为红、蓝、黑色。r1-r4为4个小区的独立重复，每一重复每一材料测量6～10株。**代表各个重复中sn28-oe各家系相对于oeck的极显著差异(studentt-test，p<0.01)。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有ossn28基因完整编码区段的dna片段，以及验证ossn28基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：分离克隆ossn28基因

申请人采用trizol试剂(购自invitrogen公司)从43℃高温处理的水稻品种中花11(又称zh11，原始材料来自中国农业科学院作物科学研究所，为常规实验材料)中提取穗部总rna(提取方法根据上述trizol试剂说明书)，利用反转录酶ssiii(购自invitrogen公司)将其反转录合成cdna，反应条件：65℃5min，42℃120min，70℃10min。以此cdna为模板，以引物sn28-f：5’-atggcgatgacaccgcagctagc-3’和sn28-r：5’-ctagccaccatggtttctttgca-3’扩增出ossn28基因的全长cdna(759bp，见序列表seqidno:2)。pcr反应条件：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的pcr产物连入pgem-teasy载体(购自promega公司)，筛选阳性克隆并测序确认，获得ossn28基因全长cdna，申请人将这个克隆命名为pgem-ossn28。

实施例2：检测水稻内源ossn28基因的表达水平

申请人选用水稻品种中花11(zh11)作为表达谱分析的材料。具体步骤如下：

(一)ossn28基因在不同逆境胁迫下的表达水平检测。种子催芽后，在正常生长条件下培养18-20天，至四叶期时进行各种逆境和植物激素处理。干旱处理是将幼苗直接从水培液(常用配方)中取出暴露于空气中，分别在胁迫前、胁迫后0.5小时、1小时、3小时、5.5小时取样；高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/lnacl的水培液中，分别在胁迫前、胁迫后0.5小时、1小时、3小时、5.5小时取样；低温胁迫是把水稻幼苗放入4℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后0.5小时、1小时、3小时、5.5小时取样。激素处理是用100μm脱落酸(aba)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后0.5小时、1小时、3小时、5.5小时取样。高温胁迫是待材料的穗即将抽出时将其移入气温约45℃的生长箱并在放置0.5小时后将整个穗部进行取样。

(二)ossn28基因在水稻不同生长时期、不同组织中的表达水平检测。中花11种子催芽后，在正常生长条件下培养生长，发芽10天后，移入栽培土盆栽，待生长至四叶期时，分别取地上绿色组织和根；在分蘖期，取茎秆；在孕穗期，分别取不同长度的幼穗；抽穗后，分别取颖壳、雄蕊、雌蕊、叶片、叶鞘和叶枕；另外还对继代培养中的愈伤组织作了取样。提取总rna的方法是采用trizol试剂(购自invitrogen公司)(提取方法根据trizol试剂的使用说明书)，利用反转录酶ssii(购自invitrogen公司)将其反转录合成cdna(方法根据invitrogen公司反转录酶试剂使用说明书操作)，反应条件：65℃5min，42℃120min,70℃10min。以上述反转录合成的cdna为模板，用引物ossn28-qf(5’-gaacgacaccgtcgggttt-3’)和ossn28-qr：(5’-ccggcgacgacgaagat-3’)对ossn28基因进行特异性pcr扩增。同时用引物(uf：aaccagctgaggcccaaga-3’和ur：5’-acgattgatttaaccagtccatga)对水稻ubiquitin1基因(loc_os03g13170)做特异扩增，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(按常规方法)。

结果表明，ossn28基因的表达受到高盐、低温、干旱胁迫的诱导，在穗部也受到高温胁迫的诱导，同时在aba处理较长时间后(3～5.5小时)也会上调表达(图2)。此外，在正常情况下，ossn28基因主要在幼苗根部和抽穗期的倒二叶、剑叶叶片及叶枕、长度小于0.3cm的幼苗中有较高表达，而在雄蕊和幼苗的地上部分中表达量较低(图3)。

实施例3：ossn28突变体的分离鉴定

从韩国postech水稻突变体库(http://www.postech.ac.kr)中挑取ossn28基因位点相应的t-dna插入突变体2d-30113(sn28m，dongjin背景)。其中在上述网站突变体库中所登录的sn28m突变体2d-30113的侧翼序列(该序列长度为850bp)，序列如下：

agtgttagcgttcaacacaccgcagctagnattttctcgcatgcntccagggtttcggttccagccgacgnacgagcagcttgtcgtcgactacttgcagaggcgtaccgntgcgcagcncntgcatnnctccngacntcacngatntcnacgttnacaacgtcgaacccgngnnagcntnccagnggcaanatanatgcncgcttnaattggcatgngcctccnnccgtacgnggnccccnacnggnngnagaantcattcnaancngtnaacntnatttncccgaatgtntcgangnncnattnntatnatgnaagnaaaancgtgaatggncgttnccntcagaaaaaaaaanngggnnnaggggaanagccgccntttngcgggggttaancnctttttccncctttttgggcttttncgannaaaaanangcgatccccgcgcaatanngganccttngatcattttncntganaaaaanaaaaacnganaaatgaattccaattcgntgnntaagcaaatcactaattnacctaaanaatccggancttggtgggatantnctnccggtagagagcnccngngcgtcgatttgcatccaggnnnggcngaannagncttaggacngggaggcttaagccttggcntgtgcnccnaacngggnnaaanccccntaaaancccnttaaatttgggaaaagaatgaatactattaaaacccntacnttgcctctctagagccgcctgctacncgagtctntgtaggcgaaaaataaaatttacctgatgcgaccggaaagnaaattttggtggnctgnaanngactagcnaattgcngntggcnngg

根据t-dna插入位点，设计引物sn28-mf：5’-cataaacggatgagtgtgcg-3’和sn28-mr：5’-gctggcatcgctcatatttc-3’，并配合t-dna特异引物2772-l2：5’–ctagctagagtcgagaattcagt-3’鉴定了sn28m纯合突变体。同时反转录，pcr结果显示，在sn28m纯合突变体中，ossn28基因的转录无法被检测到(图4中的b图)，即表明sn28m突变体中ossn28基因被显著抑制。反转录pcr使用引物sn28-rtf：5’-actacttgcagaggcgtacc-3’和sn28-rtr：5’–gctatcatcaatctcctcatc-3’扩增ossn28基因，扩增条件：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸7min，同时使用引物actin1-f：5’-ctcaaccccaaggctaacag-3’和actin1-r：5’-acctcagggcatcggaac-3’扩增水稻actin1基因作为内参，反应条件：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，26个循环；72℃延伸7min。

将已鉴定好基因型的sn28m纯合突变体和由其杂合个体分离的阴性对照材料mck催芽后直播到小圆桶中。待生长至四叶期时移栽至大圆桶中，每组材料种植八桶，每桶一株。试验用的土壤为中国南方水稻栽培土，每圆桶装土量相同，且在移栽后同一时间使用等量的自来水浇灌，待植株生长至穗发育后期、穗即将抽出时，将每组材料当中的四株同时移入气温45℃左右、相对湿度90％且关照充足的生长箱内，进行1小时高温处理，其余材料置于正常生长环境。处理结束后将材料置于正常环境继续生长，待穗完全抽出后观察所有材料穗部的形态与颖花发育情况，同时取穗顶端的5朵颖花，使用常规的碘染法检测其花粉育性，并待其扬花之后3小时，使用苯胺蓝染色法(常规方法)观测其柱头授粉情况。结果显示，正常情况下，即将开花的sn28m突变体与阴性对照mck的雄蕊形态没有显著差异，但在高温处理后再开花时，mck的雄蕊为正常的柱状且可以开裂散粉，而sn28m突变体得雄蕊为弯曲装且开裂程度较低(图5中的a图)。同时，sn28m突变体在高温处理后碘染花粉育性和柱头花粉萌发率均显著低于对照mck(图5中的b图和图5中的c图)。此外，sn28m突变体穗的靠下部的颖花(在胁迫时处于相对较早的发育时期)在高温胁迫后出现变白枯死的情况，而mck基本无此情况出现，且sn28m突变体在高温胁迫后整穗的结实率也显著低于对照材料mck(图5中的d图)。

实施例4：ossn28基因超量表达载体的构建和转化

超量表达载体构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pgem-ossn28质粒(由实施例1中得到)用引物sn28-oef(5’-ggtaccatggcgatgacaccgcagctagc-3’)和sn28-oer(5’-ggatccctagccaccatggtttctttgca-3’)，扩增出包含ossn28全长的dna片段，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。该片段用限制性内切酶kpni和bamhi消化后再用t4dna连接酶连接到同样经kpni和bamhi消化的pcambia1301u载体上，对载体进行测序确认后可用于转化。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种zh11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在hiei等人报道的方法(hiei等，efficienttransformationofrice，oryzasatival.，mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna，plantj，6:271-282，1994)基础上改良进行。转化载体中共获得了20株独立的转基因水稻植株。

具体步骤：(1)愈伤组织诱导：将成熟的水稻(中花11)种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(hgcl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的la培养基上预培养农杆菌eha105(来源于澳大利亚cambia实验室，商用菌株)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至od6000.8-1.0；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。(6)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(cn)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为羧苄青霉素浓度250ppm，潮霉素浓度250ppm)。(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(按水稻组织培养常规人工光照条件)下培养，温度26℃。(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

转化中所用试剂和培养基的配制：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；cn(carbenicillin，羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量成分溶液)；n6mix(n6微量成分溶液)；msmax(ms大量成分溶液)；msmix(ms微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方：

1)n6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10x)]的配制：

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)n6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100x)]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(fe2edta)贮存液(100x)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(na2edta·2h2o)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100x)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)ms培养基大量元素母液(10x)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6)ms培养基微量元素母液(100x)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-d贮存液，6-ba贮存液，萘乙酸(naa)贮存液，吲哚乙酸(iaa)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)as贮存液的配制：秤取as0.392g，dmso10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节ph值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlas贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节ph值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μlhn和400ppmcn，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μlhn和200ppmcn，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.8，煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

实施例5：ossn28基因超量表达转基因家系高温胁迫表型鉴定

本实施例选取了两个sn28-oe家系(oe-25和oe-27)进行了高温胁迫实验。具体步骤如下：将超量表达转基因家系水稻种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞溶液处理30min，用无菌水清洗数次)，在含有50mg/l潮霉素的1/2ms基本培养基上发芽，将由t0代sn28-oe分离而得的转基因阴性对照家系oeck晚一天播于不含潮霉素的1/2ms基本培养基上，约一周后待幼苗长至第三片叶时挑选长势一致且良好的幼苗种入小桶中。待生长至四叶期时移栽至大圆桶中，每组材料种植八桶，每桶一株。试验用的土壤为中国南方水稻栽培土，每圆桶装土量相同，且在移栽后同时间使用等量水浇灌，待植株生长至穗发育后期、即将抽出时，将每组材料当中的四株同时移入气温45℃左右、相对湿度90％且关照充足的生长箱，进行1小时高温处理，其余材料置于正常生长环境。处理结束后将材料置于正常环境继续生长，待穗完全抽出后观察所有材料穗部的形态与颖花发育情况，同时取穗顶端的5朵颖花，使用碘染法检测其花粉育性，并待其扬花之后3小时，使用苯胺蓝染色法观测其柱头授粉情况。此外，2016年夏季将相关材料使用上述方法生长至四叶期后移栽入正常灌溉的水田，共种植4个小区，每个小区oe-25、oe-27和oeck相间种植各10株，记录各材料的抽穗期(家系中所有单株从发芽到第一穗露出所用天数的平均值)以及田间的实时气温，待材料正常结实后收获黄熟的穗子并考察结实率(单株的实粒在总粒数中的比例)以及有效穗率比(单株中实粒大于5粒的穗子在所有穗子中的占比)。结果显示，在生长箱高温处理下，sn28超量表达家系oe-25和oe-27的可育花粉量和柱头授粉率显著高于阴性对照oeck(图6中的a图和图6中的b图)，且oe-25和oe-27的结实率也显著高于oeck(图6中的c图)。2016年8月的田间气温如图6中的d图所示，其中各个材料的抽穗时间区间在横轴上标出，可见各材料在抽穗时处于自然高温胁迫状态(日间最高温大于40℃，夜间最低温度大于30℃)。图6中的e图为上述田间环境下超表达材料oe-25、oe-27和阴性对照oeck的结实情况，可见oe-25、oe-27的结实能力显著强于oeck。上述田间材料的结实率与有效穗率比统计结果如图6f，r1-r4分别代表4个实验小区，可见各个小区的oe-25和oe-27的结实率和有效穗率比均显著高于oeck，说明在抽穗期自然高温环境下sn28超表达材料的抗高温能力相对阴性对照显著提升。

序列表

<110>华中农业大学

<120>ossn28基因在控制水稻耐高温中的应用

<141>2018-03-21

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1862

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<220>

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