一种具有增强免疫活性的返魂草多糖及其制备方法与应用与流程

本发明涉及由返魂草中提取分离、纯化得到的返魂草多糖及其在制备治疗慢性支气管炎、肺内感染治疗辅助药物方面的应用。

背景技术：

返魂草(Senecionis Cannabifolii Herba，SCH)为我国东北地区的一种特色资源，其药材为菊科千里光属植物返魂草的干燥全草，具有理气化痰、镇咳平喘等功效。以其为原料的单方制剂如返魂草颗粒、肺宁口服液等被广泛应用于慢性支气管炎、肺内感染等疾病的治疗，已有很多年的药用历史。近年来吉林修正、华康、紫鑫、益民、罗邦、天津中新、格润等20多家制药企业都在用其开发生产新药，经济效益可观，具有广阔的发展前景。目前对返魂草活性成分的研究报道主要集中在酚酸类和黄酮类化合物；对返魂草多糖类化合物的研究尚未见报道。

技术实现要素：

多糖类物质具有增强机体免疫力的作用，是返魂草活性不可忽视的活性物质，具有辅助增强返魂草的抗炎功效。本发明首次从返魂草药材中分离纯化得到一种返魂草多糖，研究发现其具有增强机体免疫力、抗肿瘤及抗炎等作用。

本发明技术方案如下：

一种返魂草多糖，其分子量范围在4000-6500左右，主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖构成。

进一步地，所述返魂草多糖中，半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为1:(0.40-0.80):(0.40-0.80)，优选为1:0.61:0.62。

进一步地，所述返魂草多糖的糖苷键连接方式：主链主要是以1→3、1→4和1→6连接的半乳糖组成；在1→3连接的O-6位上有分支；非还原末端主要是阿拉伯糖。

进一步地，所述返魂草多糖中，总糖含量为40-90％；在一个具体实施例中所述返魂草多糖的总糖含量为44.47％。

进一步地，所述返魂草多糖中，酸性糖含量为20-50％，在一个具体实施例中所述返魂草多糖的酸性糖含量为41.22％。

进一步地，所述返魂草多糖是从返魂草(药材)中经水提，过大孔吸附树脂D101分离，醇沉，再经Sephadex G50纯化得到的。

具体地，上述返魂草多糖的制备方法包括：将返魂草药材适当粉碎，加适量(例如10-15倍)水煎煮(例如煎煮2次，每次3h，合并滤液)，将煎煮液减压浓缩，过大孔吸附树脂D101进行分离，水洗至无色，以乙醇沉淀，沉淀物干燥，得返魂草粗多糖；将返魂草粗多糖以适量水溶解后，经Sephadex G50纯化，即得返魂草多糖。

本发明还包括上述返魂草多糖在制备具有增强机体免疫力、和/或抗肿瘤和/或抗炎功能的保健食品或药物方面的应用。

本发明还包括上述返魂草多糖在制备治疗慢性支气管炎的药物方面的应用。

本发明还包括上述返魂草多糖在制备辅助治疗肺内感染的药物方面的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

药理实验证明，返魂草多糖具有增强免疫等活性；可显著增强细胞活力，促进IL-1β，IL-6和TNF-α细胞因子的分泌；并可通过脾脏调节小鼠的免疫功能，对IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α都有逆转环磷酰胺诱导的异常分泌作用，对IFN-α也能起到调节作用，并且返魂草多糖对以上免疫调节因子的调节作用呈计量依赖性。该结果说明返魂草多糖组能通过调节白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等途径来降低由环磷酰胺造成的免疫抑制并抵抗外来物质的侵染。说明返魂草多糖对环磷酰胺引起的免疫力低下反应有一定的消除作用，但是其作用的机制及各通路间的相互作用还需进一步的探索，尤其是免疫调节活性与抗肿瘤活性之间的关系。抗炎实验表明返魂草多糖可显著降低小鼠足趾肿胀程度，并且小鼠的抗炎即抗小鼠足趾肿胀能力呈现剂量依赖性增强的趋势。所以本次研究对返魂草多糖方面的开发及应用起到了重要的意义。

附图说明

图1为返魂草多糖分子量及其分布色谱图。

图2为返魂草多糖单糖组成色谱图。

图3表示返魂草多糖对角叉菜胶致炎小鼠足肿胀度的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

本发明提供了一种从返魂草中提取返魂草多糖，通过大孔树脂D101分离、水提醇沉、G50纯化等制备返魂草多糖的方法，表征了该多糖的理化性质和平均结构，研究了该多糖对炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α细胞因子的分泌有显著的促进作用，并且免疫实验结果显示该多糖可通过脾脏调节小鼠的免疫功能，对IL-2和6都有逆转环磷酰胺诱导的异常分泌作用，说明返魂草多糖能通过调节IL-2和6的释放来提高由环磷酰胺造成的免疫力低下小鼠的免疫力，另外小鼠的IFN水平有所升高，TNF-α水平下降，说明返魂草多糖能通过调节干扰素、肿瘤坏死因子等途径来降低由环磷酰胺造成的炎症反应并抵抗外来物质的侵染。说明返魂草多糖对环磷酰胺引起的免疫力低下的反应具有一定的消除作用。体内抗炎实验表明返魂草多糖可显著降低小鼠足趾肿胀程度，并且小鼠的抗炎即抗小鼠足趾肿胀能力呈现剂量依赖性增强的趋势。

实验方法

1返魂草粗多糖的提取

返魂草药材适当粉碎，加入10-15倍的水煎煮，煎煮2次，每次3h，合并滤液，减压浓缩，过大孔吸附树脂D101进行分离，水洗至无色，以乙醇沉淀，沉淀物干燥，既得返魂草粗多糖。

2返魂草多糖的纯化

返魂草粗多糖以适量水溶解后，经Sephadex G50纯化，得返魂草多糖。

3返魂草多糖的化学特征

3.1蛋白质、总糖和糖醛酸的含量测定

总糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法，葡萄糖作为对照品，制作标准曲线，结果表明，返魂草多糖中的总糖含量为44.47％。

酸性糖含量的测定：采用间-羟基联苯法，半乳糖醛酸作为对照品，制作标准曲线，结果表明，返魂草多糖中的酸性糖含量为41.22％

3.2分子量的测定

3.2.1分子量测定采用GPC的方法

3.2.2色谱条件与系统适应性试验

用SRT SEC-100(7.8×300mm，5μm)凝胶柱；0.7％硫酸钠溶液为流动相；柱温35℃，流速0.5mL/min；示差折光检测器，理论板数按葡萄糖峰计算，应不小于5000，不同分子量的Dextran作为对照品，制作标准曲线。

3.2.3测定法

取本品10mg，加2mL流动相溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL注入色谱仪，记录色谱图，采用GPC多糖专用软件处理。

3.2.4返魂草多糖分子量结果如图1所示。

结果表明，返魂草多糖重均分子量主要分布在4000-6500之间。

3.3组成糖分析

3.3.1组成糖分析采用HPLC-PMP柱前衍生化法。

3.3.2试剂与仪器

标准品Fuc(岩藻糖)、Rha(鼠李糖)、Ara(阿拉伯糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal(半乳糖)、Glu(葡萄糖)、GalA(半乳糖醛酸)GlcA(葡萄糖醛酸)、均购自Sigma公司，纯度为99％。

LC-2010高效液相色谱仪为日本岛津公司产品。

3.3.3返魂草多糖PMP衍生物的制备

色谱条件：采用C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(pH6.8)-乙腈(85:15，v/v)；流动相B为磷酸盐缓冲液(pH6.8)-乙腈(60:40，v/v)；流速：0.9mL/min；检测波长250nm，进样量10μL。

标准品溶液的制备：取标准品单糖溶液(2mmol/L)各5mL，加0.5mol/LPMP甲醇溶液6mL，加0.3mol/L氢氧化钠溶液5mL，50℃水浴反应0.5h，加0.3mol/L盐酸溶液5mL中和，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层放置过夜，制得标准品PMP衍生物。

供试品溶液的制备：精密称取返魂草多糖样品20mg，加入2mol/L TFA于100℃水解8h，干燥后加纯化水10mL溶解，精密量取5mL供试品溶液，衍生化方法同上，制得样品PMP衍生物。分别取标准品和样品PMP衍生物进行单糖组成分析。

3.3.4返魂草多糖单糖组成分析结果如图2所示。

结果表明：返魂草多糖是由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为1:0.61:0.62。

4返魂草多糖化学结构表征

4.1返魂草多糖的化学结构分析采用甲基化的方法进行。

4.2试剂与仪器

气质联用仪(GC-MS)为Agilent公司的6890N/5973MSD，DB-One石英毛细管柱(30m×0.25mm)。

4.3脱水DMSO的制备

4A分子筛于马弗炉烘3h后放入平底烧瓶中，加入DMSO，放入转子密封搅拌过夜，静置至澄清。

4.4NaOH-DMSO混悬液制备

4A分子筛于240℃烘干3h，放凉后加入DMSO密封搅拌过夜。称取1gNaOH，加入1mL水溶解，加入1mL脱水DMSO搅拌，离心。重复此操作10-15次。沉淀加入1mL脱水DMSO，充氮气密封搅拌过夜，备用。

4.5甲基化

样品20mg真空干燥24h，加入脱水DMS0 0.5mL，充氮气密封搅拌过夜。加入0.5mLNaOH-DMSO混悬液，充氮气密封搅拌30min，加入0.3mL碘甲烷，充氮气密封搅拌30min。加2mL水终止反应。加3mL氯仿，搅拌离心，弃去水层，氯仿层用水洗脱2次。吹干氯仿层，得全甲基化多糖。

4.6水解还原乙酰化

将全甲基化样品加2mol/L三氟乙酸1ml，密封，置121℃水解1.5小时，吹干，残渣加甲醇1ml，吹干，反复三次。残渣加1mol/L氨水0.5ml,加硼氢化钠20mg，室温还原1.5小时，滴加冰醋酸至无气泡产生，吹干，残渣加10％醋酸甲醇溶液1ml，吹干，反复三次。还原后样品置五氧化二磷保干器过夜，分别加0.5ml吡啶，1ml醋酸酐密封，置121℃烘箱中3小时，水解液放冷后吹干，残渣加1ml甲醇吹干，反复三次。残渣加3ml水溶解，加1ml三氯甲烷萃取三次，三氯甲烷层吹干，残渣加少量丙酮溶解，作为供试品溶液，进行GC-MS分析。

4.7分析条件

DB-One石英毛细管柱(30m×0.32)，进样口温度250℃。柱温120℃保持5min，5℃/min升到220℃。进样量0.2μL。根据保留时间和质谱碎片峰，确定糖的种类和糖苷键的连接方式。

4.8甲基化分析结果

实验表明：其糖苷键连接方式主要以半乳糖的1→3、1→4和1→6连接为主，在1→3连接的O-6位上有分支；非还原末端主要是阿拉伯糖。

5返魂草多糖体内免疫活性分析

5.1返魂草多糖对RAW264.7细胞活力的影响

5.1.1MTT法检测细胞活性

取处于对数生长期的细胞接种于96孔细胞培养板上，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，四周为PBS，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。将其分为空白、LPS(1×10^-3mg/mL)、返魂草多糖(1、0.5mg/mL)。每孔100μL，空白组加入完全培养基，培养24h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，培养4h，倾去液体，加入150μL DMSO，振荡10min，置于酶标仪于490nm下测定吸光度值，计算细胞活力。细胞活力计算公式如下：

5.1.2ELISA法检测RAW264.7细胞分泌IL-1β、Il-6、TNF-α的水平

取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于12孔细胞培养板上，细胞密度为1×105个/mL，每孔1mL，四周为PBS，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。将其分为空白、LPS(1×10-3mg/mL)、返魂草多糖(1、0.5mg/mL)组，每个浓度设4个复孔，培养24h，吸取各组细胞培养液，3000rpm离心5min，取上清，测定IL-1β、Il-6、TNF-α的分泌情况。

5.1.3返魂草多糖对RAW264.7细胞活力的影响的结果

5.1.3.1与空白组比较，返魂草多糖(1mg/mL、0.5mg/mL)均可显著增强细胞活力(P<0.01)。

5.1.3.2与空白组比较，返魂草多糖(1mg/mL、0.5mg/mL)可显著促进IL-1β，IL-6，TNF-α细胞因子的分泌(P＜0.01，P<0.001)。

5.2返魂草多糖体内免疫调节活性实验

5.2.1实验方法

5.2.1.1动物分组及给药方案

BALB/c小鼠共分为5组，每组20只，雌雄各半。将小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组及返魂草多糖溶液低、高剂量组。(1)空白对照组，给予0.1ml生理盐水，每日1次。(2)模型组，第1-3日腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)注射液80mg/kg，第4-18日给予生理盐水，每日1次。(3)阳性对照组，第1-3日腹腔注射环磷酰胺注射液80mg/kg，第4-18日给予0.20mg/Kg胸腺素α1(Thymosinα1，Tα1)，每日1次。(3)返魂草多糖溶液组，第1-3日给予环磷酰胺注射液80mg/kg，第4-18日给予低、高剂量返魂草多糖溶液，相当于5、10mg/Kg，每日1次，灌胃给药。结果共监测14天。5.2.1.2小鼠体重和免疫器官指数测定

第0、3、10和17天测量各组小鼠体重。于末次给药次日，用电子天平精确称量小鼠体重，眼球取血后处死，取脾脏用滤纸吸干脏器表面液体并称重，并计算胸腺和脾脏指数。按如下公式计算:

脏器指数指数＝脏器质量(mg)/体重(g)。

5.2.1.3免疫相关细胞因子检测

样品制备：摘除小鼠眼球眼静脉丛血液0.5-1ml，血液样本在室温静止放置2h。离心2000g×20min，收集血清，分装在-20℃备用。按照ELISA检测试剂盒要求测定血清中IL-2，IL-6及IFN-α、IFN-γ、TNF-α的水平。

5.2.2体内免疫调节活性实验结果

5.2.2.1体重和免疫器官指数

分别在建模前后及治疗的第10和17天记录小鼠体重，于17天后解剖小鼠取其脾脏和胰腺称重，根据脏器指数公式计算脾脏指数和胸腺指数，结果如表1所示。

表1返魂草多糖对小鼠体重及脏器指数的影响

注：与空白组相比#P<0.05；与模型组相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

结论：测定结果如表1所示，环磷酰胺注射三天后，各组小鼠体重显著下降(P<0.05)，经过返魂草多糖治疗后小鼠的体重回复到正常水平。同时，与模型组相比返魂草多糖高、低剂量均能引起小鼠脾脏指数显著增加(P<0.01)，但是胸腺指数并没有显著变化。综合来看，本实验环磷酰胺诱导的免疫低下模型建立成功，推测返魂草多糖主要通过脾脏调节小鼠的免疫功能。

5.2.2.2免疫相关细胞因子水平

细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的、能够调节细胞功能的小分子多肽，免疫应答过程中，细胞因子能够调节细胞间相互作用，参与免疫调节和炎症的发展。IL-2、IL-6、IFN-α、IFN-γ和TNF-α水平测定结果如表2所示。

表2返魂草多糖对细胞因子水平的影响

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

如表2所示，Tα1与返魂草多糖对IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α都有逆转环磷酰胺诱导的异常分泌作用，对IFN-α也能起到调节作用，并且返魂草多糖对以上免疫调节因子的调节作用呈计量依赖性。该结果说明返魂草多糖组能通过调节白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等途径来降低由环磷酰胺造成的免疫抑制并抵抗外来物质的侵染。

6返魂草多糖体内抗炎活性分析

6.1实验动物

Balb/c小鼠，雌性，体重20-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号:SYXK(京)2017-0013。正常饲养温度(22±1)℃，相对湿度55％-65％，12h光照周期，自由进食、进水。

6.2动物分组及给药方案

动物购买后适应性饲养3d后随机分组:正常对照组、模型对照组、阿司匹林阳性对照组(100mg·kg)和返魂草多糖治疗组(剂量为10.0mg/Kg和30mg/Kg)，每组20只。动物连续给药3d。末次给药后，除正常对照组外，其他各组动物自足跖中部皮下注射1％的角叉菜胶30μl。

6.3小鼠足肿胀度测定

于注射角叉菜胶4h后，用足趾容积测量仪测定小鼠的足趾体积。通过比较各组足肿胀程度，评价药物抗炎作用。

由图3可知，角叉菜胶可以导致小鼠足趾体积显著增加至正常组水平的1.62倍。阿司匹林(100mg/Kg)和返魂草多糖的低、高剂量均可以显著降低小鼠足趾肿胀程度。

6.4炎症因子水平测定

根据ELISA试剂盒说明书测定小鼠足跖组织中IL-1β、NF-κB和TNFα水平，实验结果见表3。

表3返魂草多糖对小鼠足趾中炎性因子的影响(n＝2，)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

根据表3可以看出，角叉菜胶可以引起小鼠足趾中促炎症因子IL-β、NF-κB和TNFα水平显著增加，说明小鼠的足趾中发生炎症。采用返魂草多糖灌胃治疗3天后，小鼠的抗炎即抗小鼠足趾肿胀能力呈现剂量依赖性增强的趋势。

综上所述：本次返魂草多糖为首次从返魂草药材中分离纯化得到。返魂草多糖的分子量在6119左右；主要由甘半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖构成，其糖苷键连接方式为：主链为1-3、4和6连接的半乳糖组成；在1→3连接的O-6位上有分支；其非还原末端主要是阿拉伯糖。药理实验证明，返魂草多糖具有增强免疫等活性；可显著增强细胞活力，促进IL-1β，IL-6和TNF-α细胞因子的分泌；并可通过脾脏调节小鼠的免疫功能，对IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α都有逆转环磷酰胺诱导的异常分泌作用，对IFN-α也能起到调节作用，并且返魂草多糖对以上免疫调节因子的调节作用呈计量依赖性。该结果说明返魂草多糖组能通过调节白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等途径来降低由环磷酰胺造成的免疫抑制并抵抗外来物质的侵染。说明返魂草多糖对环磷酰胺引起的免疫力低下反应有一定的消除作用，但是其作用的机制及各通路间的相互作用还需进一步的探索，尤其是免疫调节活性与抗肿瘤活性之间的关系。抗炎实验表明返魂草多糖可显著降低小鼠足趾肿胀程度，并且小鼠的抗炎即抗小鼠足趾肿胀能力呈现剂量依赖性增强的趋势。多糖类成分具有增强机体免疫力的作用，是返魂草活性不可忽视的活性物质，是有辅助增强返魂草的抗炎功效。所以本次研究对返魂草多糖方面的开发及应用起到了重要的意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。