本发明涉及1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物、其制备方法、药物组合物及其应用。
背景技术：
：sirtuin是一类nad+依赖性的蛋白去乙酰化酶，它们在氨基酸序列和结构上具有高度的同源性。sirtuin蛋白广泛存在于古菌、线虫、果蝇、酵母以及哺乳动物等多种生命体内，调控了包括细胞衰老、转录、细胞凋亡、炎症、应激、线粒体合成以及机体生物钟在内的多种重要的生物过程。酵母sir2基因是第一个被发现的sirtuin蛋白。早在20世纪七十年代，人们就发现sir2基因可以维持酵母端粒的长度、调节rdna编码的dna重复序列的生成。后来发现sir2基因可以通过抑制基因组的不稳定性来延长酵母的寿命，敲除酵母sir2基因可以明显缩短酵母的寿命，而过表达sir2基因则能延长酵母约40％的寿命。同样，在线虫体内过表达sir2.1(sir2的同源基因)可以延长线虫约50％的寿命，在果蝇中也有类似的现象。这些发现使得对sirtuin家族蛋白的研究变得更加热门。哺乳动物基因组编码七种sirtuin蛋白，分别命名为sirt1-7，它们含有一个由nad+结合区域和酶活催化区域组成的、高度保守的核心区域以及长度、序列可变的n-端和c-端。sirtuin蛋白n-端和c-端的差异可以影响蛋白与配体的结合、介导蛋白与其他sirtuin亚型的相互作用或者影响它们的亚细胞定位。现有研究结果表明，sirt1、sirt6和sirt7是核蛋白，但是sirt1也可以通过核质转运从细胞核进入细胞质中，从而对细胞质应激反应中的靶蛋白进行调节。sirt2主要位于细胞基质中，不过sirt2可以通过核质转运进入到细胞核中，而sirt3、sirt4和sirt5主要位于线粒体中。哺乳动物的sirtuin分布在不同的亚细胞层，这与它们作用的底物和生物学功能密切相关。sirt1是哺乳动物sirtuin家族蛋白中在序列上最接近酵母sir2的，也是哺乳动物sirtuin家族中最早被研究的成员。sirt1通过去乙酰化h1k26、h3k9和h4k16来调节异染色质的形成，此外，sirt1也参与非组蛋白的去乙酰化。sirt1的非组蛋白底物可分为三类：(1)转录因子：如p53、foxo3a、e2f2、bcl6等；(2)dna修复蛋白：如ku70和mre11-rad50-nbs1(mrn)等；(3)信号因子：smad7等。sirt1通过对组蛋白底物以及非组蛋白底物的去乙酰化，参与调节包括基因表达、能量代谢和衰老在内的多种生理功能。sirt1与多种疾病的发生、发展密切相关，它可以通过去乙酰化nf-κb的p65/rela亚基，抑制小胶质细胞中aβ聚集，从而控制阿尔兹海默氏症(ad)的发展。sirt1还可以通过去乙酰化pgc-1α并增加pgc-1α活性，在亨廷顿症(hd)疾病模型中保护神经细胞。已知肿瘤抑制因子p53蛋白参与包括dna修复、细胞生长阻滞、衰老和凋亡在内的多种生理过程，已成为癌症治疗的重要靶标之一。而sirt1可以去乙酰化p53的第382位赖氨酸残基，去乙酰化p53会导致肿瘤的发生。sirt1还可以通过去乙酰化dna修复因子ku70和叉头转录因子foxos，增强细胞dna修复作用，抑制dna损伤引起的细胞凋亡。研究表明，抑制sirt1活性可以诱使肿瘤细胞生长停滞，并促进肿瘤细胞凋亡。另外，sirt1可通过去乙酰化组蛋白h1的第26位、h3的第9位、h4的第16位赖氨酸来调节肿瘤抑制基因的转录，从而参与肿瘤细胞周期的调节。研究发现，在大部分实体瘤以及包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌和白血病在内的血液系统恶性肿瘤中都检测到sirt1蛋白的过度表达。由于sirt1的过度表达与癌症的发生相关，所以抑制sirt1的活性可以有效地抑制癌细胞增殖，同时诱导癌细胞凋亡。因此，sirt1有可能成为肿瘤治疗的新靶点，sirt1抑制剂可以成为潜在的抗癌备选药物。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种通式(i)所示的1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物、其可药用的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体。本发明的另一个目的在于提供一种上述通式(i)所示化合物的制备方法。本发明的再一个目的在于提供一种包含治疗有效量的一种或多种上述通式(i)所示化合物或其可药用的盐的药物组合物。本发明的又一个目的在于提供上述通式(i)所示化合物在制备用于治疗sirt1去乙酰化酶活水平相关的疾病，例如癌症、免疫病症和炎症的药物中的用途。本发明的第一方面，提供式i所示化合物、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体或外消旋体，或它们的混合物：其中，r1和r7各自独立地为氢、c1-c6烷基或c2-c12不饱和烃基；r2、r3、r4、r5、r6各自独立地为氢、卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、取代或未取代的c1-c12烷基、取代或未取代的c2-c12不饱和烃基、取代或未取代的c1-c6烷氧基、取代或未取代的c1-c6酰基、取代或未取代的c3-c12环烃基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的c6-c12芳基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的3-12元杂环基、-l1-(ch2)m-c(＝o)-n(r8)(r9)，其中，l1为无、-o-或-s-；m为0、1、2、3、4或5；r8和r9各自独立地选自：氢、取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c3-c8环烷基、取代或未取代的3-12元杂环基、或取代或未取代的c6-c12芳基；所述取代是指包含选自下组的一个或多个取代基：卤素、羟基、苯基、c1-c12烷基、c1-c12卤代烷基、c2-c12不饱和烃基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷氧基、c3-c12环烃基、3-12元杂环基、氰基、硝基、羟甲基、羧基、巯基；且r6的数量为1-3个。在另一优选例中，r1和r7各自独立地为氢、c1-c4烷基或c2-c4不饱和烃基。在另一优选例中，r2、r3、r4、r5各自独立地为氢、卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、取代或未取代的c1-c4烷基、取代或未取代的c2-c6不饱和烃基、取代或未取代的c1-c4烷氧基、取代或未取代的c1-c4酰基、取代或未取代的c3-c6环烃基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的c6-c12芳基、-l1-(ch2)m-取代或未取代的4-10元杂环基、-l1-(ch2)m-c(＝o)-n(r8)(r9)，其中，l1为无、-o-或-s-；m为0、1、2、3、4或5；r8和r9各自独立地选自：氢、取代或未取代的c1-c4烷基、取代或未取代的c3-c6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环基、或取代或未取代的c6-c12芳基；所述取代是指包含选自下组的一个或多个取代基：卤素、羟基、苯基、c1-c4烷基、c1-c4卤代烷基、c2-c4不饱和烃基、c1-c4烷氧基、c1-c4卤代烷氧基、c3-c6环烃基、3-6元杂环基、氰基、硝基、羟甲基、羧基、巯基。在另一优选例中，r3为氢、卤素、羟基、-l1-(ch2)m-3-10元杂环基、-l1-(ch2)m-c6-c10芳基、-l1-(ch2)m-c6-c10芳基-羧基、c1-c4烷氧基、3-6元杂环基、-l1-(ch2)m-c(＝o)-n(r8)(r9)，其中，l1为无、-o-或-s-；m为0、1、2或3；r8和r9各自独立地选自：氢、c1-c4烷基或苯基。在另一优选例中，r2、r4各自独立地为氢、卤素、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基或-l1-(ch2)m-c6-c10芳基，其中，l1为无、-o-或-s-；m为0、1、2或3。在另一优选例中，r5为氢或c1-c4烷氧基。在另一优选例中，所述化合物为：本发明的第二方面，提供第二方面所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：a)丙二酸与取代苯甲醛或酮反应得到化合物ia；b)化合物ia与取代苯甲醛或酮反应得到式i所示化合物，其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7的定义如第一方面所述。在另一优选例中，所述化合物的制备方法包括以下步骤：a)将丙二酸与取代苯甲醛或酮溶解在溶剂中，于加热搅拌反应得化合物ia，所述溶剂为醋酐；b)将化合物ia与取代苯甲醛或酮溶解于甲醇中，于室温下搅拌反应得到终产物。本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述组合物包含第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体或外消旋体，或它们的混合物；以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。本发明的第四方面，提供第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、对映异构体、非对映异构体或外消旋体，或它们的混合物的用途，(a)用于制备sirt1去乙酰化酶的抑制剂；或(b)用于制备治疗与sirt1蛋白异常表达或与其酶活水平相关疾病的药物。在另一优选例中，所述sirt1蛋白异常表达或与其酶活水平相关疾病选自：神经退行性疾病、癌症、代谢疾病、免疫病症和炎症。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一赘述。附图说明图1为体外sirt1酶活实验结果图，说明化合物s3以浓度依赖的方式抑制sirt1活性图2为化合物s3对sirt1蛋白的抑制类型图，a)、b)分别为固定nad+浓度，改变底物多肽浓度时，检测化合物s3对底物abz多肽的米氏常数曲线和双倒数曲线。c)、d)分别为固定底物abz多肽浓度，改变nad+浓度时，检测化合物s3对nad+的米氏常数曲线和双倒数曲线。说明化合物s3是底物多肽abz的竞争性抑制剂，是nad+的非竞争性抑制剂。图3为微量热泳动实验(mst)检测化合物s3与蛋白的结合曲线图。说明化合物s3竞争性结合底物多肽abz的结合位点的结果图。图4中a)化合物s3与sirt1结合的分子模拟结果图；b)sirt1突变体酶动力实验结果图。具体实施方式本发明人基于长期而深入的研究，制备了一类具有式i所示结构的化合物，并发现其具有sirt1抑制活性。且所述的化合物在低浓度下对sirt1产生抑制作用，抑制活性相当优异，因而可以用于治疗与sirt1活性或表达量相关的疾病如神经退行性疾病、代谢疾病、肿瘤。在此基础上，完成了本发明。术语如本文所用，术语“c1-c12烷基”指具有1-12个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基和异己基，或类似基团。“c1-c6烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烷基，“c1-c4烷基”是指具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链烷基，以此类推。术语“c1-c12卤代烷基”指被1、2、3或更多个卤素取代的具有1-12个碳原子的直链或支链烷基，如三氟甲基等。术语“c2-c12不饱和烃基”是指具有2-12个碳原子的直链或支链烯基或炔基，例如乙烯基、丙炔基等。术语“c1-c6烷氧基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基、或类似基团。所述的“c1-c6烷氧基”定义中包括“c1-c4烷氧基”。术语“c3-c12环烃基”是指环上具有3-12个碳原子的饱和或不饱和烃基，如环丙基、环丁基、环己基、环己烯基等。术语“c3-c8环烷基”是指环上具有3-8个碳原子的饱和烃基，如环丙基、环丁基、环己基等。术语“c6-c12芳基”指具有6-12个碳原子的单环或稠合双环，具有共轭的π电子体系的取代基，例如苯基和萘基，或类似基团。所述的“c6-c12芳基”定义中包括“c6-c10芳基”。术语“3-12元杂环基”指具有3-12个环原子的单环或稠合双环，且环系上具有一个或多个(优选1-5个)选自o、s、n或p的杂原子，例如哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、四氢呋喃基、吗啉基、苯并二氧戊环基、四氢吡咯基或类似基团。所述的“3-12元杂环基”定义中包括“4-10元杂环基”。术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、羧基、未取代或卤代的c1-c6烷基、未取代或卤代的c2-c6酰基、未取代或卤代的c1-c6烷基-羟基。除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为r构型或s构型，或r构型和s构型的混合物。如本文所用，术语“本发明化合物”指式i所示的化合物。该术语还包括及式i化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸、苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。式i化合物本发明式i化合物结构如下所示：各取代基的定义如前所述。优选的化合物如下表所示：表1、化合物编号、名称及化学结构式sirt1活性抑制剂及其应用本发明化合物可抑制一种或多种sirtuin蛋白的活性。举例而言，本发明化合物可用于抑制需抑制sirtuin酶活的细胞中或患者中该酶的活性，通过将抑制量的本发明化合物施用于该细胞、个体或患者而实现对sirtuin蛋白功能的抑制。经对本发明化合物对sirt1、sirt2、sirt3和sirt5的抑制活性数据分析可知，本发明化合物是sirt1的选择性抑制剂，且选择性较阳性化合物ex527来说更好。作为sirt1抑制剂，本发明化合物适用于治疗与sirt1异常表达或活性相关的各种疾病。所述与sirt1活性或表达量相关的增殖异常疾病包含但不限与以下疾病：组织细胞性淋巴瘤、卵巢癌、头颈磷状上皮细胞癌、胃癌、乳腺癌、儿童肝细胞癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肺癌、肉瘤、鼻咽癌、胰腺癌、成胶质细胞癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、睾丸癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌、乳头状肾细胞癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、食道癌、白血病、肾细胞癌、膀胱癌、肝癌和星形细胞瘤、胶质瘤、非恶性皮肤癌等。更优选地用于治疗乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌和白血病在内的血液系统恶性肿瘤。本发明的化合物和组合物用于治疗、预防或调控代谢相关疾病，包括糖尿病、高血脂、肥胖、高血糖高渗综合征。本发明的化合物和组合物用于治疗、预防或调控神经退行性疾病，包括阿尔茨海默症、帕金森症、亨廷顿症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓小脑共济失调和脊髓性肌萎缩症。本发明的有益之处在于：本发明的1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物毒性低，溶解性好。本发明的1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物及其衍生物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单、对应选择性好等优点。本发明的1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物及其衍生物对sirt去乙酰化酶有很好的抑制活性和优良的选择性。因此，本发明的化合物可用于治疗与sirt1蛋白异常表达或活性相关的各种疾病，如神经退行性疾病、糖尿病、肿瘤等疾病。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1化合物5-(4-氯亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s1)的制备反应式1.1步骤1:制备2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮将丙二酸(10.4g,100mmol)置于圆底烧瓶，加入乙酸酐(28.4ml,300mmol)，室温搅拌，加入0.1ml浓h2so4，搅拌过夜。于室温下，缓慢加入苯甲醛(10.2ml,100mmol)，在5℃下过夜反应，反应结束后。加入约30ml甲苯，减压浓缩除去乙酸酐，析出白色固体，抽滤后用200ml水洗涤滤饼，得到粗产物。将粗产物溶于丙酮，加入适量水后析出固体，搅拌15分钟后抽滤，水洗滤饼，得到2-苯基-1,3-二氧-4,6-二酮(10.2g,产率53％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.56(dtd,j＝10.2,5.1,2.0hz,5h),7.13(s,1h),4.56(d,j＝18.4hz,1h),3.61(d,j＝18.4hz,1h).ms(esi,m/z):191(m-h)－。反应式1.2步骤2:制备s1将2-苯基-1,3-二氧-4,6-二酮(0.3g，1.56mmol)溶于无水dmso中，加入无水醋酸钠(90mg,1.09mmol)室温下搅拌使其溶解，加入4-氯苯甲醛(0.22g，1.56mmol)，搅拌过夜，向溶液中加入约30ml水，搅拌使固体析出，抽滤，水洗涤滤饼，烘干后得到粗产物，甲醇/石油醚重结晶得到纯品310mg，收率63％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.32(s,1h),8.08-7.94(m,2h),7.65-7.58(m,2h),7.56-7.40(m,5h),6.76(s,1h).实施例2化合物5-(4-羟基-3-碘-5-甲氧基亚苄基)-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s2)的制备反应式2.1步骤1:制备2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮将丙二酸(15.6g,150mmol)置于圆底烧瓶，加入乙酸酐(55.5ml,585mmol)，室温搅拌，加入0.2ml浓h2so4，搅拌过夜。于室温下，缓慢加入苯乙酮(35ml,300mmol)，反应1小时后，减压浓缩除去乙酸酐，经快速分离柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝15/1,v/v)分离纯化得产物2-甲基-2-苯基-1,3-二氧-4,6-二酮(9.3g,产率30％)。ms(esi,m/z):205(m-h)－。反应式2.2步骤2:制备s2将2-甲基-2-苯基-1,3-二氧-4,6-二酮(0.3g，1.45mmol)溶于无水dmso中，加入无水醋酸钠(84mg,1.02mmol)室温下搅拌使其溶解，加入4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛(0.41g，1.45mmol)，搅拌过夜，向溶液中加入约30ml水，搅拌使固体析出，抽滤，水洗涤滤饼，烘干后得到粗产物，甲醇/石油醚重结晶得到纯品340mg，收率50％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.59(s,1h),7.78-7.68(m,4h),7.42-7.22(m,4h),3.78(s,3h),1.86(s,3h).实施例3化合物5-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s3)的制备除了以3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s3,最后一步反应产率56％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.17(d,j＝6.8hz,2h),7.91(s,1h),7.64–7.40(m,5h),7.08(s,1h),3.82(s,3h).ms(esi,m/z):404(m-h)－。实施例4化合物5-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-烷基甲氧基)-3-甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s4)的制备除了以4-(苯并-1,3-二氧戊环-5-烷基甲氧基)-3-甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s4,最后一步反应产率68％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.34(s,1h),8.22-8.18(m,1h),7.64-7.42(m,6h),6.99-6.76(m,4h),6.70(s,1h),5.96(s,2h),5.18(s,2h),3.90(s,3h)。实施例5化合物3-({4-[(4,6-二氧-2-苯基-1,3-二恶烷-5-基亚基)甲基]苯氧基}甲基)苯甲酸(s5)的制备除了以3-((4-甲酰苯氧基)甲基)苯甲酸替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s5,最后一步反应产率23％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(s,1h),8.08-7.92(m,2h),8.05-8.01(m,1h),7.95-7.85(m,1h),7.62-7.50(m,3h),7.48-7.38(m,4h),7.10-7.01(m,2h),6.88(s,1h),5.20(s,2h)。实施例65-(4-羟基-3-碘-5-甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s6)的制备除了以4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s6,最后一步反应产率70％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.65(s,1h),8.14(s,1h),8.08-7.92(m,2h),7.56-7.48(m,2h),7.42-7.38(m,3h),6.82(s,1h),3.83(s,3h)。实施例75-(3-乙氧基-4-羟基亚苄基)-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s7)的制备除了以3-乙氧基-4-羟基苯甲醛替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s7,最后一步反应产率46％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08-8.01(m,2h),7.54-7.25(m,5h),6.91-6.84(m,1h),6.35(s,1h),4.22-4.10(m,2h),1.56(s,3h),1.50-1.42(m,3h)。实施例85-亚苄基-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s8)的制备除了以苯甲醛替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s8,最后一步反应产率62％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.06(s,1h),7.74-7.68(m,2h),7.58-7.28(m,8h),1.98(s,3h)。实施例93-({2-甲氧基-4-[(2-甲基-4,6-二氧-2-苯基-1,3-二恶烷-5-基亚基)甲基]苯氧基}甲基)苯甲酸(s9)的制备除了以3-((4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)甲氧基)苯甲酸替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s9,最后一步反应产率45％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.18-8.02(m,3h),7.88(s,1h),7.70-7.65(m,1h),7.55-7.46(m,3h),7.40-7.28(m,4h),6.88-6.82(m,1h),5.22(s,2h),3.86(s,3h),1.90(s,3h)。实施例105-(3-氯-4-羟基-5-甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s10)的制备除了以4-羟基-3-氯-5-甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s10,最后一步反应产率72％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.15(s,1h),7.90-7.82(m,1h),7.80-7.74(m,1h),7.58-7.45(m,2h),7.42-7.36(m,3h),6.82(s,1h),3.84(s,3h)。实施例115-(2,5-二甲氧基亚苄基)-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s11)的制备除了以2,5-二甲氧基苯甲醛替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s11,最后一步反应产率54％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.50(s,1h),7.58-7.50(m,2h),7.43-7.30(m,3h),7.25-7.20(m,1h),7.05-7.02(m,1h),6.80-6.75(m,1h),3.78(s,3h),3.76(s,3h),1.96(s,3h)。实施例125-(3-乙氧基-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s12)的制备除了以3-乙氧基-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s12,最后一步反应产率43％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.22(s,1h),8.20-8.04(m,2h),7.60-7.38(m,6h),6.90-6.82(m,2h),4.14-4.02(m,2h),1.43-1.38(m,3h)。实施例135-(2-甲氧基亚苄基)-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s13)的制备除了以2-甲氧基苯甲醛替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s13,最后一步反应产率76％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.51(s,1h),7.58-7.52(m,3h),7.44-7.30(m,4h),6.91-6.82(m,2h),3.80(s,3h),1.98(s,3h)。实施例145-(2-异丙氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s14)的制备除了以2-异丙氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s12,最后一步反应产率43％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.22(s,1h),8.20-8.04(m,2h),7.60-7.38(m,6h),6.90-6.82(m,2h),4.14-4.02(m,2h),1.43-1.38(m,3h)。实施例155-(3,5-二氯-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s15)的制备除了以3,5-二氯-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s15,最后一步反应产率68％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.15-8.07(m,3h),7.58-7.39(m,6h),6.93(s,1h)。实施例165-(4-羟基亚苄基)-2-甲基-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s16)的制备除了以4-羟基苯甲醛替换4-羟基-3-碘-5-甲氧基苯甲醛之外，以与实施例2相同的方式制备化合物s16,最后一步反应产率76％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(s,1h),7.93-7.82(m,2h),7.56-7.44(m,2h),7.40-7.28(m,3h),6.87-6.80(m,2h),5.93(s,1h),1.94(s,3h)。实施例175-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-烷基甲氧基)亚苄基]-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s17)的制备除了以4-(苯并-1,3-二氧戊环-5-基甲氧基)苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s17,最后一步反应产率41％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(s,1h),8.23-8.16(m,2h),7.64-7.58(m,2h),7.51-7.42(m,3h),7.08-6.80(m,5h),6.70(s,1h),5.96(s,2h),5.06(s,2h)。实施例185-(4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s18)的制备除了以4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s18,最后一步反应产率55％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.56(s,1h),8.19(s,1h),8.10-8.02(m,2h),7.55-7.43(m,2h),7.42-7.35(m,3h),6.85-6.75(m,3h)。实施例192-苯基-5-(2,3,4-三甲氧基亚苄基)-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s19)的制备除了以2,3,4-三甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s19,最后一步反应产率58％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.78(s,1h),8.28-8.20(m,1h),7.63-7.40(m,5h),6.78-6.68(m,2h),4.01(s,3h),3.95(s,3h),3.84(s,3h)。实施例202-苯基-5-[4-(1-四氢吡咯基)亚苄基]-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s20)的制备除了以4-(1-四氢吡咯基)苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s20,最后一步反应产率22％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.32(s,1h),8.28-8.19(m,2h),7.68-7.58(m,2h),7.52-7.40(m,3h),6.64-6.52(m,3h),3.58-3.40(m,4h),2.18-1.97(m,4h)。实施例212-{4-[(4,6-二氧-2-苯基-1,3-二恶烷-5-基亚苄基)甲基]苯氧基}-n-苯乙酰胺(s21)的制备除了以2-(4-甲酰基苯氧基)-n-苯乙酰胺替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s21,最后一步反应产率36％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.98(s,1h),8.25(s,1h),8.20-8.01(m,2h),7.62-7.50(m,4h),7.49-7.40(m,3h),7.28-7.20(m,2h),7.18-6.97(m,4h),4.78(s,2h)。实施例225-(5-溴-2,4-二甲氧基基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s22)的制备除了以5-溴-2,4-二甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s22,最后一步反应产率65％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.66(s,1h),8.01(s,1h),7.59(ddd,j＝7.3,2.0,1.0hz,2h),7.44(s,1h),7.42–7.34(m,2h),7.37–7.29(m,1h),6.75(s,1h),3.89(d,j＝10.1hz,6h).实施例235-(3-苄基-4-羟基-5-甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s23)的制备除了以3-苄基-4-羟基-5-甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s23,最后一步反应产率78％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.42(s,1h),8.22(s,1h),8.04(s,1h),7.75(s,1h),7.69–7.45(m,5h),7.32–7.05(m,6h),3.92(s,2h),3.85(s,3h).ms(esi,m/z):415(m-h)－。实施例245-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s24)的制备除了以4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s24,最后一步反应产率82％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.22(s,1h),8.28(s,1h),7.79(s,2h),7.65–7.60(m,2h),7.57–7.49(m,3h),7.13(s,1h),3.82(s,6h).ms(esi,m/z):355(m-h)－。实施例255-(3-氟-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s25)的制备除了以3-氟-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s25,最后一步反应产率74％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.48(s,1h),8.27(dd,j＝13.4,1.8hz,2h),7.89(dd,j＝8.6,2.1hz,1h),7.62(dd,j＝6.8,3.0hz,2h),7.54(dd,j＝5.1,1.9hz,3h),7.14(s,1h),7.08(t,j＝8.8hz,1h).ms(esi,m/z):313(m-h)－。实施例265-(3-溴-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s26)的制备除了以3-溴-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s26,最后一步反应产率75％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.81(s,1h),8.60(d,j＝2.2hz,1h),8.23(s,1h),8.04(dd,j＝8.7,2.2hz,1h),7.65–7.59(m,2h),7.57–7.50(m,3h),7.15(s,1h),7.06(d,j＝8.6hz,1h).ms(esi,m/z):374(m-h)－。实施例275-(3,5-二溴-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s27)的制备除了以3,5-二溴-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s27,最后一步反应产率75％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.48(s,2h),8.18(s,1h),7.66–7.58(m,2h),7.57–7.49(m,3h),7.11(s,1h).ms(esi,m/z):453(m-h)－。实施例285-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s28)的制备除了以3,5-二氟-4-羟基苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s28,最后一步反应产率73％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24(s,1h),8.08–8.03(m,2h),7.64–7.59(m,2h),7.57–7.51(m,3h),7.15(s,1h).ms(esi,m/z):331(m-h)－。实施例295-(4-羟基-3,5-二碘亚苄基)-2-苯基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(s29)的制备除了以4-羟基-3,5-二碘苯甲醛替换4-氯苯甲醛之外，以与实施例1相同的方式制备化合物s29,最后一步反应产率80％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.75(s,1h),7.62–7.55(m,2h),7.52–7.45(m,3h),7.08(s,3h),6.81(s,1h).ms(esi,m/z):547(m-h)－。药理学实验本发明测定了1,3-二氧六环-4,6-二酮类化合物对sirt去乙酰化酶活的抑制活性，药理学实验所用实验材料除特殊说明外，均为商业购买。一、sirt1酶活力检测用dmso将多肽abz-gvlk(ac)ay(no2)gv-nh2配制成10mm的储存液，分装后冻存于-80℃冰箱中；nad+用酶活反应缓冲液(25mmtris，ph8.0，137mm氯化钠，2.7mm氯化钾，1mm氯化镁)配制成50mm的储存液；用dmso将小分子化合物配制成10mm的储存液。测定化合物ic50时，对化合物进行梯度稀释。反应体系为100μl，体系中含有1μmsirt1、500μmnad+、10μm底物多肽和相应浓度的化合物，每个反应条件3个副孔，每个实验重复3次。在37℃振荡反应30min后，向每孔中加入50μl终浓度为10mm烟酰胺和0.01mg/ml胰蛋白酶来终止反应和进行酶切。37℃反应15min后，用酶标仪读取荧光值，激发波长和发射波长分别为320nm和420nm。如表1所示，这类化合物都是1,3-二氧六环-4,6-二酮的c2位连接一个苯基，c5位连接一个亚苄基结构。运用sirt1酶活力检测实验，检测了这批化合物抑制sirt1去乙酰化酶活性的ic50(表2)，表明该类化合物对sirt1去乙酰化酶活都有抑制作用。由于sirtuin家族的各个亚型在生命体中都有非常重要的作用，所以在设计sirt1小分子抑制剂时，要考虑抑制剂对sirtuin其他亚型的抑制作用，选择几个活性化合物、检测了它们对sirt2、sirt3和sirt5的抑制活性。在此实验中，选用sirt1抑制剂ex527作为阳性化合物。按照测定小分子化合物对sirt1抑制作用的ic50检测方法，以及各组分的浓度配比来检测这些化合物对sirt1同源蛋白的抑制作用。如表3所示，该类化合物是sirt1的选择性抑制剂，且选择性较阳性化合物ex527来说更好。由此可见，本发明的化合物对sirt1具有很好的抑制活性，且有较好的选择性。表2：化合物对sirt1去乙酰化酶活性的抑制作用化合物ic50(μm)化合物ic50(μm)s118.81±0.42s151.20±0.09s22.45±0.37s167.06±0.10s31.31±0.26s173.41±0.19s48.14±0.97s186.33±0.21s510.04±0.57s1915.79±1.36s60.89±0.01s214.51±1.17s77.92±1.79s224.89±0.35s8>50s232.47±0.10s912.88±2.09s2411.90±2.62s101.90±0.53s254.65±0.05s1116.75±0.71s261.40±0.43s125.49±0.95s270.70±0.03s1314.38±1.86s284.54±0.03s1414.01±2.01s290.46±0.09表3：部分化合物对sirt1、sirt2、sirt3、sirt5去酰化酶活性的抑制作用二、酶动力学反应测试体外sirt1酶活实验表明，化合物s3以浓度依赖性方式抑制sirt1酶活(见图1)，s3抑制sirt1的ic50为1.31±0.26μm,接下来选用化合物s3、采用米氏常数曲线(michaelis-mentenplot)和双倒数曲线(lineweaver-burkplot)来检测这类抑制剂的抑制类型。由于sirt1的去乙酰化酶反应需要乙酰化多肽、nad+作为双底物，所以在进行酶动力学反应时，需要固定一个反应底物浓度而改变另一个反应底物浓度，分别来判断抑制剂对sirt1的底物乙酰化多肽和nad+的抑制类型：1)固定nad+浓度为1mm来测定抑制剂对乙酰化多肽的抑制类型：固定sirt1蛋白浓度为0.5μm，乙酰化多肽的浓度分别为50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm，抑制剂s3的浓度分别1.875μm、0.9375μm、0.46875μm和0μm。在37℃振荡反应15min后，酶切15min，用酶标仪进行检测。2)固定乙酰化多肽浓度为30μm来测定抑制剂对nad+的抑制类型：固定sirt1蛋白浓度为0.5μm，nad+的浓度分别为1000μm、500μm、250μm、125μm、62.5μm和31.25μm，抑制剂s3的浓度分别1.875μm、0.9375μm、0.46875μm和0μm。在37℃振荡反应15min后，酶切15min，用酶标仪进行检测。实验结果如图2所示。图2中a、b分别为固定nad+浓度、改变底物abz多肽浓度时，化合物s3对abz多肽的米氏常数曲线和双倒数曲线。图2中c、d分别为固定abz多肽浓度、改变nad+浓度时，化合物s3对nad+的米氏常数曲线和双倒数曲线。从图2中b可以看出，在对底物abz多肽作图时，在不同化合物浓度下曲线交于第三象限，说明随着化合物s3浓度增高，初速度v0减小，表观米氏常数km′减小，所以化合物s3对底物多肽是混合型抑制，且化合物s3与sirt1的结合可能在底物多肽的结合位点。而对nad+作图时(图2中d)，在不同化合物浓度下，曲线交于横轴，说明随着化合物s3浓度增高，初速度v0减小，表观米氏常数km′不变，所以化合物s3对nad+是非竞争性抑制，s3与sirt1结合不在nad+的结合位点。三、微量热泳动(microscalethermophoresis，mst)实验将mini-hsirt1蛋白高速离心(12,000rpm，10min)除去气体后，室温静置30min。向1mlmini-hsirt1蛋白中加入100μl100倍蛋白摩尔浓度的tcep(pbbuffer溶解)，用氮气冲洗装有蛋白的离心管后迅速盖上离心管，彻底混匀后放置10min。再向离心管中加入50μl10倍蛋白摩尔浓度的cy5tm染料溶液(dmso溶解)，用氮气冲洗装有蛋白的离心管后迅速盖上离心管，彻底混匀后放置。室温孵育2小时，且每隔半小时混匀一次，之后放置4℃过夜。称2gsm-2吸附剂(bio-rad)，用1～2倍柱体积的甲醇活化填料，再用水和缓冲液(20mmhepes，ph7.2，200mm氯化钠，5％甘油)冲洗。将上述蛋白液流过填料后，用缓冲液冲洗填料，收集流穿液，测定sirt1蛋白浓度。在进行mst实验之前，将被标记的sirt1cy5蛋白高速离心(13,000rpm，5min)，除去聚集体。标记的sirt1cy5蛋白用mst优化缓冲液(50mmtris，ph7.4，150mm氯化钠，10mm氯化镁，0.05％吐温-20)稀释至200nm备用。反应体系中，固定sirt1cy5浓度为100nm，化合物设定为初始浓度500μm、倍比稀释16个梯度，且保持体系中dmso含量为10％。使用monolithnt115(nanotempertechnologies)测定三种条件下的mst曲线(monolithnt115参数设置为20％red，mstpower40.0％，excitationpower20％)：1)sirt1cy5与化合物s3相互作用曲线2)在500μm多肽abz-gvlk(ac)ay(no2)gv-nh2参与下，sirt1cy5与化合物s3相互作用曲线3)在5mmnad+参与下，sirt1cy5与化合物s3相互作用曲线。实验数据用mo.affinityanalysis软件分析，得出mst结合曲线。如图3所示，在abz多肽的参与下，化合物s3与sirt1蛋白的结合曲线发生右移，kd值增大，说明化合物s3对abz多肽是竞争性抑制剂。而在nad+参与时，化合物s3与sirt1蛋白的结合曲线并未发生明显变化，说明化合物s3对nad+是非竞争性抑制剂。四、分子模拟与突变体实验从rcsb-pdb数据库(www.rcsb.org)中下载sirt1/ex527的复合物晶体复合物结构(pdbid：4i5i)，将结构中ex527分子去除，提取一个sirt1蛋白分子的坐标，保存为pdb文件。将化合物s3对接到sirt1蛋白结构中，并根据构效关系分析结合模型。如图4中a所示，化合物s3与sirt1第273位苯丙氨酸、346位天冬酰胺、347位异亮氨酸、348位天冬氨酸以及414位苯丙氨酸有结合，所以对这5个氨基酸残基进行定点突变，并检测了化合物s3对这些sirt1突变体蛋白的抑制常数(ki)。从图4中b中可以看出，化合物s3对sirt1野生型的ki值为0.16μm，化合物s3对突变体sirt1f273l、sirt1n346a、sirt1i347a、sirt1d348a、sirt1f414a的抑制率常数ki分别为0.85μm、2.47μm、0.67μm、4.33μm和25.5μm，由此可见，化合物对突变体蛋白的抑制常数均有所提高，其中突变体sirt1f414a对化合物抑制活性影响最大，基于结合模型，发现化合物的c2位苯基与第414位苯丙氨酸之间有疏水作用，这些都说明sirt1第414位苯丙氨酸是“蛋白/s3小分子化合物”结合的关键氨基酸残基，提示在下一步结构改造时可适当增加化合物苯基的疏水性，来进一步提高化合物活性。另外，根据结合模型发现，化合物c5位亚苄基r3位的羟基与sirt1第346位天冬氨酸残基形成氢键，而对第346位天冬氨酸残基进行突变后，化合物s3对突变体蛋白的敏感性降低，说明该位点也是化合物结合的关键位点。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用，作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12