本发明属于红树内生真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种红树内生真菌中聚酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
海洋来源的内生真菌结构新颖活性独特的化合物重要来源之一。近年来，一些新的活性化合物已经从真菌d.eschscholtzii中分离得到，例如：免疫抑制活性化合物dalesconolsa-b和spirodalesol，诱导干细胞分化的化合物selesconol，具有细胞毒活性的化合物daldinonef，抗真菌化合物helicascolidec。前期研究发现内生真菌d.eschscholtzii乙酸乙酯粗提物具有一定的抗菌活性。
技术实现要素：
本发明所述的红树内生真菌分离自红树尖瓣海莲内生真菌(daldiniaeschscholtzii)其基因序列已提交至ncbi，其genebank：mh059553.1，locus:mh059553，以下该红树内生真菌以daldiniaeschscholtzii表示。
本发明提供一对非对映异构的聚酮类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述非对映异构的聚酮类化合物具有化合物1、2所示的结构：
本发明的另一实施方案，提供上述化合物1、2的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将daldiniaeschscholtzii菌株接入种子培养基，26～28℃，培养3～4天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～28℃静置培养21～24天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0∶100梯度洗脱，其中20％乙酸乙酯-石油醚洗脱部分经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为石油醚：chcl3∶meoh＝2：1∶1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15最终得到上述化合物1、2。
其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
本发明提供一种药物组合物，其特征在于以本发明上述化合物1、2或其药学上可接受的盐作为活性成分。
本发明提供的上述药物组合物，还可包含其他抗菌药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1、2或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1、2或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的用途。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。
附图说明
图1是化合物1的ecd谱图
图2是化合物2的ecd谱图
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)daldiniaeschscholtzii的菌种培养
配制种子培养基：葡萄糖80g，蛋白胨8g，酵母膏8g，粗海盐10g，水4.0l，平均分装于8个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将daldiniaeschscholtzii菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)daldiniaeschscholtzii的发酵
配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水50l，平均分装于75个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养21天。
(3)化合物1、2的提取分离
取步骤(2)得到的发酵物过滤，分离发酵液和菌体，将滤液浓缩后，分别用等体积的乙酸乙酯萃取浓缩后的滤液和菌体各3次；合并萃取液，浓缩后经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0:100梯度洗脱，其中20％乙酸乙酯-石油醚洗脱部分经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为石油醚：chcl3∶meoh＝2：1∶1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh∶h2o＝85∶15，最终得到化合物1(12.0mg)、2(11.5mg)。
表1化合物1和2的1h和13c-nmr(400/100mhz,cdcl3)数据(ppm)
化合物1：高分辨质谱数据357.1693[m+h]+，理论值为357.1697[m+h]+。
化合物2：高分辨质谱数据357.1693[m+h]+，理论值为357.1697[m+h]+。
进一步根据二维核磁图谱1h-1hcosy，hmqc和hmbc确定化合物1、2的相对构型。
确定绝对构型，化合物1和2的绝对构型是通过ecd计算来确定的。采用ecd含时密度泛函理论方法(tddft)对化合物1和2进行ecd曲线的计算。计算的1'r,3's构型的ecd曲线与化合物1实验测试得到的ecd曲线相吻合，而计算的1'r,3'r构型的ecd曲线与化合物2测试的ecd曲线相吻合，因此也确定了化合物1和2的绝对构型分别为1'r,3's和1'r,3'r。
实施例2
(1)daldiniaeschscholtzii的菌种培养
配制种子培养基(5.0l)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于8个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将daldiniaeschscholtzii菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
(2)daldiniaeschscholtzii的发酵
配制发酵培养基(100l)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于150个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养24天。
(3)化合物1、2的提取分离
按照实施例1中类似的分离方法，可得到化合物1和2，结构确证数据与实施例1一致。
实施例3
(1)daldiniaeschscholtzii的菌种培养
配制种子培养基(1.0l)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将daldiniaeschscholtzii菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
(2)daldiniaeschscholtzii的发酵
配制发酵培养基(20l)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于30个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养22天。
(3)化合物1、2的提取分离
按照实施例1中类似的分离方法，可得到化合物1、2，结构确证数据与实施例1一致。
实施例4本发明化合物1、2的抗菌活性的测定
试验方法：取化合物1、2对6株致病菌进行活性测试，6株致病菌包括2株海洋致病菌和4株陆地致病菌，分别为溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistants.aureus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)。
在96孔板的第一排中加入190μl的菌液，其余各排均加入100μl菌液。在样品孔和阳性对照孔的第一排中分别加入10μl相应的待测样品及阳性药，用排枪进行混匀后取出100μl加入到第二排，再次混匀后加入到第三排，依次逐排混匀稀释八个梯度，阳性对照稀释十二个梯度，最后将所有孔补加菌液至200μl。空白对照为200μl空白培养液，阴性对照为10μldmso和190μl菌液。将96孔板放置室温下培养过夜。将96孔板放置酶标仪下(492nm)测试吸光度，计算mic值。环丙沙星为阳性对照药。
试验结果如下：
表2：
上表中：mic：最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration)。
ciprofloxacina为阳性对照。
试验结果表明两个化合物有一定的抗菌活性，对s.aureus,mrsa,b.cereus菌株具有较好的抑制活性，mic值为6.15-12.5。