本发明属于生物学领域，涉及一株地衣芽孢杆菌，具体涉及一株产纤维素酶而且抑制假交替单胞菌的芽孢杆菌及使用方法。
背景技术：
随着水产养殖业的飞速发展，高密度的集约化养殖规模日益扩大，水产养殖的环境恶化和疾病的危害对水产养殖业的经济损失也愈加明显。而传统的解决办法是采用抗生素。众所周知，抗生素的使用容易产生耐药性菌株的问题，并且会在体内残留。益生菌是一定浓度范围内可以对动物体产生有益作用的活的微生物。益生菌通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，起到了促进动物生长的作用。因此，近些年来，作为抗生素的部分领域的替代品，益生菌得到迅速的发展。目前益生菌已经广泛应用于鱼类、贝类、虾类以及刺参的养殖中。bagheri等(2008)将不同浓度的复合芽孢杆菌制剂添加到虹鳟饲料中进行两个月的投喂，结果发现高浓度的复合益生菌制剂可以明显促进虹鳟生长。doeschate等(2008)研究证明南非鲍分离得到的土著益生菌群可以提高其消化酶活力，促进生长。iehata等(2009)发现乳酸菌对鲍鱼肠道消化酶活性提高有一定的作用。发明专利申请201510896838.8提供了“一株地衣芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂”。该发明专利申请具体提供了一株新型地衣芽孢杆菌dn29(bacilluslicheniformisdn29)，其保藏编号为cctccno：m2015482。所述的地衣芽孢杆菌dn29，能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。所述地衣芽孢杆菌dn29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对假交替单胞菌的抵抗能力。发明专利申请201610812192.5公开了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，该菌种已于2016年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号是cctccno.m2016202。该发明添加了地衣芽孢杆菌cctccno.m2016202的秸秆腐熟剂能原位降解农作物秸秆、促进秸秆还田，尤其在秋冬季节温度较低的条件下仍能发挥作用。综上可知，现有技术中报道的芽孢杆菌菌株，有些提高刺参生长和抗病力或免疫力，有些可以分泌纤维素酶。但目前还没有报道同时可以抑制主要致病菌和分泌纤维素酶的菌株。技术实现要素：本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，所述菌株一方面能向细胞外分泌纤维素酶，所述纤维素酶可以分解饲料中的纤维素；另一方面能有效抑制刺参腐皮综合征(又称腐皮病)的主要致病菌——假交替弧菌。本发明的技术方案：一株产纤维素酶且抑制弧菌的地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌xw015(bacilluslicheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15648，保藏日期为2018年4月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述地衣芽孢杆菌xw01516srdna序列如seqno.3所示。所述的地衣芽孢杆菌的活化方法，将地衣芽孢杆菌接种到lb培养基中，在32-38℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l。所述的地衣芽孢杆菌的应用，将所述地衣芽孢杆菌应用于刺参的养殖。所述地衣芽孢杆菌应用于刺参的养殖包括两种方法：(1)采用所述地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料；(2)将所述地衣芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中。其中，所述方法(1)具体为：(a)将所述地衣芽孢杆菌菌株活化(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，然后取适量，投入到初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参养殖饲料；所述地衣芽孢杆菌菌液的重量分数为3-8％。(b)向混合刺参养殖饲料中加入适量水，所述水的量为初始刺参养殖饲料重量的1.5-3倍，然后在30-38℃的温度条件下发酵12-32小时，即发酵刺参饲料。发酵后得到的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。用该菌株发酵刺参饲料，能使饲料中的纤维素分解为可溶性多糖，更加有利于刺参的消化吸收。其中，所述方法(2)具体为：将活化好的菌液，均匀投放在刺参养殖池中，使菌液的浓度为8-20ppm；并根据消耗量定期补充以维持该浓度。具体步骤为：将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)稀释10倍，然后再均匀投放到刺参养殖池中。5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，可以有效抑制养殖刺参以及水体环境中的致病菌，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。一种包括所述的地衣芽孢杆菌的发酵刺参饲料，通过上述方法(1)制备得到。所述发酵刺参饲料的使用方法，其特征在于：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4-1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中；所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的1-3％。本发明的有益效果：(1)本发明中的地衣芽孢杆菌xw008分泌的纤维素酶可以分解饲料的粗纤维，提高饲料的利用率；另一方面能有效抑制刺参腐皮病的主要致病菌——假交替单胞菌，避免了刺参腐皮病带来的经济损失。(2)采用本发明所述的菌株发酵的刺参饲料养殖刺参，可以使饲喂2个月的刺参的增重率提高近60个百分点；同时抑制刺参养殖过程中的假交替单胞菌，减少发病率，成活率可以提高近9个百分点；一方面降低了致病菌所导致的刺参养殖过程中的损失，另一方面增加了生长速度而产生了巨大的经济效益，对于刺参养殖产业的发展具有重要的意义。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例1：菌株的分离与筛选1.1有益菌的分离(1)初筛：取1g待筛选的样品(土壤或底泥)，加入99ml无菌水中，制备悬液，然后梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6，然后将在超净工作台中，均匀涂布于羧甲基纤维素固体培养基平板上，放于恒温培养箱中30℃恒温正置培养1小时，再倒置培养至长出单菌落。将培养出来的菌株，分别接种到另外一个培养基上，将一定量的1mg/ml浓度的刚果红溶液倒入培养好的平板中，使之覆盖住平板表面，染色1小时后，倒出刚果红溶液，再用1mol浓度的nacl溶液浸泡洗脱，出现清晰透明圈，则为产纤维素酶的菌株，透明圈大，则产酶能力强。初筛培养基配方如下(500ml)：羧甲基纤维素钠(cmc-na)10g，硫酸铵1.4g，硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，硫酸锰1.6mg，硫酸铁5mg，硫酸锌2.5mg，氯化钴2.0mg，琼脂20g。ph8.0。(2)复筛：将初筛的菌株接种到羧甲基纤维素液体培养基中，30℃，180rpm振荡培养24小时，然后取5ml接种到100ml羧甲基纤维素液体培养基中，30℃，振荡培养2小时，再离心(4℃、8000rpm)10分钟，取上清液做为粗酶液，然后用dns法测纤维素酶的活力。酶活力值大的即为目的菌株。实施例2：菌株的鉴定提取菌液总dna，作为菌液pcr模板，以27f和1492r引物进行pcr扩增。pcr反应体系(10μl)：cdna1μl、10×buffer1μl、2.5mmdntp0.8μl、10μm正反引物各0.5μl，0.05μlrtaq酶、2h2o6.15μl。pcr引物：pcr反应条件为：整个反应结束后，反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工sanprep柱式试剂盒说明书进行dna回收、纯化。回收dna-20℃保存或用于转化链接。将回收产物与pmd18-t克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列pmd18-t重组载体。连接体系如下：回收产物4.5ulpmd18-t0.5ulsolutioni5ul将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态dh5α中，碎冰浴30min，42℃热激30s，置于冰上。加入650μl已经预热至37℃的lb培养基，37℃震荡培养1h。然后5000rpm离心3min，弃大部分上清，将剩余约150μl上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100mg/ml氨苄青霉素钠(amp)的lb平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12-16h。挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物27f和1492r进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至上海桑尼生物公司测序。最后，将目的菌株的cdna序列进行blast比对，确定菌株种属。实施例3：菌株活化条件将所述地衣芽孢杆菌菌株，接种到lb培养基中，在30-38℃的温度条件下培养8-10小时，得到活化后的地衣芽孢杆菌。所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l。实施例4所述地衣芽孢杆菌，对假交替单胞菌的抑制作用把扩大培养后的假交替单胞菌(细菌含量为1.0*105cfu/ml-1.0*107cfu/ml)，无菌操作下准确稀释10倍，分别吸取20μl在lb固体培养基上用涂布棒涂板，每个菌株涂3个平板。然后用灭菌的滤纸片吸取本发明所述地衣芽孢杆菌，放置于涂布假交替单胞菌的平板上每个菌三次重复。培养12小时后，经观察，有清晰透明圈出现，证明所述地衣芽孢杆菌对假交替单胞菌具有拮抗作用。实施例5：采用所述地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参(1)取500g活化后的地衣芽孢杆菌菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。(2)向10kg混合刺参饲料中加入20kg水，然后在38℃的温度条件下发酵12小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的3％。即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.8kg、19.5kg和20.6kg，平均为19.97kg。增重率分别为296.0％、290.0％和312.0％，平均为299.3％。成活率分别为92.0％、89.0％和93.0％，平均为91.3％。对照组1(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的3％/天，即实验开始时投喂0.15kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.8kg，16.1kg和17.1kg，平均为16.3kg。增重率分别为216％、222％和242％，平均为226.7％；成活率为82％、83％和81％，平均为82.0％。实施例6：采用所述地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参与实施例4不同的是，(1)取300g活化后的地衣芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料；(2)向10kg混合刺参饲料中加入30kg水，然后在35℃的温度条件下发酵22小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:6的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为19.6kg、20.2kg和19.5kg，平均为19.8kg。增重率分别为292％、304％和290％，平均为295.3％。成活率分别为91％、90％和92％，平均为91.0％。对照组2(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为16.4kg，17.2kg和15.8kg，平均为16.5kg。增重率分别为228％、244％和216％，平均为229.3％。成活率为83％、86％和82％，平均为83.7％。实施例7：采用所述地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参与实施例4不同的是，(1)取800g活化后的地衣芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料。(2)向10kg混合刺参饲料中加入15kg水，然后在30℃的温度条件下发酵32小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:4的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.3kg、19.7kg和19.8kg，平均为19.9kg。增重率分别为306％、294％和296％，平均为298.7％。成活率分别为93％、92％和89％，平均为91.3％。对照组3(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为17.0kg，16.4kg和16.2kg，平均为16.5kg。增重率分别为240％、228％和224％，平均为230.7％。成活率为82％、82％和83％，平均为82.3％。实施例8：采用所述地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参与实施例4不同的是，(1)取650g活化后的地衣芽孢杆菌液，投入到10kg初始刺参养殖饲料中，混合均匀，得到混合刺参饲料；(2)向10kg混合刺参饲料中加入25kg水，然后在32℃的温度条件下发酵18小时，即得到发酵刺参饲料。发酵后的刺参饲料为浆状液体，具有发酵香味。(3)喂养刺参：将所述发酵刺参饲料与海泥(海底的浮泥，是海水中的泥沙和少数动植物碎屑及底栖硅藻等的混合物)，按照1:5.5的重量比混合均匀，然后将其投放在刺参养殖水中。所述每日的投放量为待喂养刺参总重量的2％，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂持续60天后，全池称重并计数，计算增重率和成活率。三个池重量分别为20.7kg、19.6kg和18.3kg，平均为19.5kg。增重率分别为314％、292％和266％，平均为290.7％。成活率分别为92.0％、90.0％和88.0％，平均为90.0％。对照组4(未使用本发明菌株饲料饲喂刺参)：饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的1％/天，即实验开始时投喂0.05kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.8kg，16.2kg和17.5kg，平均为16.5kg。增重率分别为216％、224％和250％，平均为230.0％。成活率为82％、83％和80％，平均为81.7％。表1实施例5-8有益菌株发酵饲料对刺参生长及成活率的影响初重，kg末重，kg增重率,％成活率,％实施例55.020.0299.391.3对照组15.016.3226.782.0实施例65.019.8295.391.0对照组25.016.5229.383.6实施例75.019.9298.791.3对照组35.016.5230.782.3实施例85.019.5290.790.0对照组45.016.5230.081.6实施例9：将所述地衣芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中(1)将所述地衣芽孢杆菌菌株，按照实施例3所述方法活化。(2)将活化好的菌液(细菌含量为1.0*108cfu/ml-1.0*109cfu/ml)先用养殖池的海水稀释10倍，然后再均匀投放到刺参养殖池中。使用浓度为8-20ppm，每5天补充投放一次，每次倒池(即将池中刺参连同刺参的附着基一起移至一个经过清理消毒的养殖池)后补充投放一次。在养殖水体中泼洒该菌株，一方面，可明显降解水体中残饵和粪便中的纤维素，净化水质；另一方面可以有效抑制养殖刺参以及水体环境中的致病菌，提高刺参成活率，起到提高养殖效益的作用。所试验的三个养殖池中，初始重量都为5kg，用普通未发酵饲料饲喂60天后，重量分别为17.6kg、17.7kg和18.9kg，平均为18.1kg；增重率分别为252％、254％和278％，平均为261.3％；成活率分别为89％、90％和91％，平均为90.0％。对照组5：(如发酵饲料的对照)选取约500头/500g，大小基本相同的刺参，随机放入3个大小为15立方米水体池中，每个池内放5kg。饲喂普通商品饲料，饲喂比率为刺参的2％/天，即实验开始时投喂0.1kg饲料/池，于第二天上午检查剩料情况，并根据摄食情况调整饲料的投喂量。饲喂时间为60天后，全池称重，三个池重量分别为15.5kg，16.9kg和17.7kg，平均为18.1kg；增重率分别为210％、238％和254％，平均为234.0％；成活率为80％、82％和81％，平均为81.0％。表2实施例9有益菌株泼洒水体对刺参生长、成活率的影响初重，kg末重，kg增重率,％成活率,％对照组55.016.7234.381.0实施例85.018.1261.390.0实施例10：所述地衣芽孢杆菌的对致病菌感染的保护率在9个70升的玻璃水槽中，每个槽中投放30头规格为每头10g的刺参，经过7天暂养后，随机选择6个在水体中泼洒刺参腐皮病的致病菌——假交替单胞菌，浓度为10ppm，另外的3个留作对照。然后在该泼洒了致病菌的6个槽中，随机选择3个，泼洒15ppm的本发明所述的地衣芽孢杆菌，在处理后的第2天、第4天和第7天观察刺参的发病率，计算对致病菌感染的保护率。所述的3个泼洒了致病菌的水槽，第2天即有6头刺参发病，症状为嘴部肿胀和部分刺变白，而同时泼洒了本发明地衣芽孢杆菌的3个槽中仅有1头有发病症状，经计算，对假交替单胞菌感染的保护率为83.3％。第4天时，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为28头，发病率达到31.1％，而同时泼洒了本发明地衣芽孢杆菌的3个槽中仅有5头发病，发病率为5.6％，保护率为82.1％。到第7天，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为34头，发病率达到37.8％，而同时泼洒了本发明地衣芽孢杆菌的3个槽中仍仅有5头发病，发病率为5.6％，保护率为85.3％。表3.实施例10中地衣芽孢杆菌对致病菌感染的保护率由表1可知，采用本申请所述的地衣芽孢杆菌发酵刺参饲料，并喂养刺参；60天后增重率为290.7％-299.3％，成活率为90.0-91.3％；而对照组的刺参，增重率为226.0％-230.6％，成活率为81.6％-83.7％。与对照组相比，采用本申请所述的地衣芽孢杆菌发酵的刺参饲料喂养的海参，增重率上涨了67个百分点，而成活率也增加了近9个百分点。由表2可知，将本申请所述的地衣芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中，采用普通养殖饲料喂养刺参，60天后，刺参增重率为261.3％，成活率为90.0％；而对照组(未泼洒菌液)的刺参增重率为234.3％，成活率为81.0％。与对照组相比，将地衣芽孢杆菌的菌液泼洒在刺参养殖池中的刺参，增重率上涨了27个百分点，成活率增加了9个百分点。综上可知，本申请所述的地衣芽孢杆菌，无论是用于发酵刺参饲料还是泼洒在刺参养殖池中，均可以使刺参的生长速度加快，提高刺参的成活率。此外，如表3所示，所述的3个泼洒了致病菌的水槽，第2天有6头发病，而同时泼洒了地衣芽孢杆菌的3个槽中仅有1头有发病症状；因此，地衣芽孢杆菌对假交替单胞菌感染的保护率为83.3％。第4天时，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参为28头，发病率达到31.1％，而同时泼洒了本发明地衣芽孢杆菌的3个槽中仅有5头发病，发病率为5.6％，保护率为82.1％。到第7天，3个泼洒了致病菌的水槽中的发病刺参发展为34头，发病率达到37.8％，而同时泼洒了本发明地衣芽孢杆菌的3个槽中仍仅有5头发病，发病率为5.6％，保护率为85.3％。充分说明，本申请所述的地衣芽孢杆菌对于假交替单胞菌具有抑制作用，可以有效的保护刺参不受致病菌的侵害。综上所述，本发明中的地衣芽孢杆菌xw015一方面通过其分泌的纤维素酶可以分解饲料的粗纤维，提高饲料的利用率，增加刺参的生长速度；另一方面能有效抑制刺参腐皮病的主要致病菌——假交替单胞菌，避免了刺参腐皮病带来的经济损失。当前第1页12