本发明属药物化学技术领域，具体涉及苯醌亚胺类衍生物、制备方法及其应用。
背景技术
苯醌因具有共轭二酮结构使得其成为氧化还原反应的活性中心，而苯醌亚胺类衍生物其结构与苯醌高度相似，使得其有望具有优越的氧化还原性能而表现出较好的生物活性。但是目前基于苯醌亚胺类衍生物的制备及活性的研究鲜有报道。百里香酚作为最常见的单酚类化合物，具有较好的抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等显著的药理活性，并且廉价易得，因此可作为一种药物合成的母体进行修饰。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种苯醌亚胺类衍生物、制备方法及其应用，本发明以百里香酚为母体进行修饰，首先通过硝化反应得到中间产物2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚。在此基础上进行衍生化，引入氨基以及功能性定位基团三苯基膦，合成四种苯醌亚胺类衍生物。因其存在共轭不饱和二酮类似的结构，使得其具有优越的氧化还原性能，能够消除细胞内过量的活性氧(ros)，维持细胞内的氧化还原平衡，抑制了由于氧化应激而导致的炎症反应的发生；并且能够有效地诱导炎症细胞的凋亡，减少炎症反应的效应细胞，表现出一定抗炎的优越药理活性。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明所涉及到的苯醌亚胺类衍生物的结构式如下所示：
本发明的苯醌亚胺类衍生物的制备方法，具体步骤如下：
(1)、取百里香酚溶于有机溶剂，然后加入浓盐酸，冰浴条件下加入nano3，其中，百里香酚与nano3的摩尔比为1:1-1:1.2，冰浴搅拌3-5h，然后室温搅拌24h，tlc跟踪反应，至反应完全后倾入冰水中，调节溶液ph值为7，萃取、干燥、浓缩、柱层析分离，得到中间产物2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚；
反应方程式如下：
(2)、取氯化亚锡溶于浓盐酸，然后分批次加入步骤(1)制得的2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚，温度逐渐升至60℃，然后加入乙醇，升温至80℃搅拌3-5h，tlc跟踪反应，待反应结束，旋出有机溶剂，然后倒入冰水中，调节溶液ph值为7，萃取、干燥、柱层析分离，得到苯醌亚胺类衍生物nbq’；其中，2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚与氯化亚锡的摩尔比为1:8；
反应方程式如下：
(3)、取步骤(2)制备的苯醌亚胺类衍生物nbq’溶于弱酸性水溶液中，然后分批次加入高锰酸钾，60℃搅拌，tlc跟踪，待反应完全后调节ph值为7，萃取、干燥、柱层析分离，得到苯醌亚胺类衍生物nbq；其中，所述的苯醌亚胺类衍生物nbq’与高锰酸钾的摩尔比为1:0.8；
反应方程式如下：
(4)、取苯醌亚胺类衍生物nbq’溶于乙腈，然后依次加入碘乙烷、三乙胺及nai，110℃搅拌，tlc跟踪，反应结束后，加水终止反应，萃取、干燥、柱层析分离，得到苯醌亚胺类衍生物enbq’；其中，所述的nbq’、碘乙烷、三乙胺及nai之间的摩尔比为1:1:1.5:0.1；
反应方程式如下：
(5)、取苯醌亚胺类衍生物nbq’溶于乙腈，加入(4-溴丁基)三苯基溴化膦，120℃搅拌，tlc跟踪，反应结束后，加水终止反应，萃取、干燥、柱层析分离，得到苯醌亚胺类衍生物pnbq’；其中，所述的nbq’与(4-溴丁基)三苯基溴化膦的摩尔比为1:1.1；
反应方程式如下：
进一步地，所述的有机溶剂为乙醇或乙腈。
进一步地，所述的浓盐酸的质量分数为38％，浓盐酸与百里香酚的摩尔比为1:1。
进一步地，所述的冰浴条件为0℃的冰水混合物。
进一步地，所述的弱酸性水溶液为ph为4-5的稀盐酸。
本发明同时还提供了苯醌亚胺类衍生物在抗炎药物方面的应用。具体地，对得到的四种苯醌亚胺类衍生物进行初步的生物活性测试，选择常作为炎症细胞模型的小鼠巨噬细胞raw264.7为实验对象。通过生物活性测试发现，四种化合物均能够抑制no及ros的生成，从而有效地降低炎症因子il-1α及il-1β的表达；同时能够诱导炎症细胞的凋亡。四种苯醌亚胺类衍生物均表现出一定的抗炎活性，在抗炎药物的开发方面具有一定的潜能。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
本发明通过引入电负性较弱的氮原子合成得到了抗氧化性能更为优越的苯醌亚胺衍生物。具体包括氮原子的引入使苯醌亚胺能够在本体上直接进行修饰，解决其进一步衍生化问题；烷基化反应提高了化合物的膜透过性及生物利用度；三苯基膦的引入增强了药物的靶向性。使得最终得到的四种苯醌亚胺衍生物具有优越的抗氧化活性从而表现出较好的抗炎性能。
附图说明
图1为本发明实施例1的2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚的核磁共振谱图；
从图中可以看出，核磁共振参数如下：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ1.16(d,j＝6.0hz6h),2.19(s,j＝1.8hz,3h),3.11(m,j＝7.0hz,1h),6.34(s,1h),7.54(s,1h).
图2为本发明实施例2的nbq’的核磁共振谱图；
从图中可以看出，核磁共振参数如下：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ1.24(d,j＝6hz6h),2.12(s,3h),3.14(m,j＝7hz1h),3.36(s,1h),4.32(s,1h),6.52(s,1h),6.57(s,1h).
图3为本发明实施例3的nbq的核磁共振谱图：
从图中可以看出，核磁共振参数如下：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ1.14(d,j＝6hz6h),2.05(s,1h),3.04(m,j＝7hz,1h),6.53(s,1h),6.60(s,1h).
图4为本发明实施例4的enbq’的核磁共振谱图：
从图中可以看出，核磁共振参数如下：1hnmr(300mhz,cdcl3)δ1.27(d,j＝6hz,6h),1.31(t,j＝9hz3h),2.10(s,3h),3.11-3.28(brs,3h),3.92(s,1h),6.51(s,1h),6.56(s,1h),
图5为本发明实施例5的pnbq’的核磁共振谱图：
从图中可以看出，核磁共振参数如下：1hnmr(300mhz,cdcl3),δ7.76(m,6h),7.50(m,8h),6.62(s,1h),6.55(s,1h),3.89(t,j＝5.6hz,2h),3.13(qq,j＝6.3,6.9hz,1h),2.37(m,2h),2.17(s,3h),1.90(m,2h),1.26(m,2h),1.10(d,j＝6.9hz,6h).
图6为本发明实施例合成的四种苯醌亚胺衍生物的no测试结果图；
图7为本发明实施例合成的四种苯醌亚胺衍生物的ros测试结果图；
其中，a为细胞成像结果图；b为荧光分析结果图；
图8为本发明实施例合成的四种苯醌亚胺衍生物的il-1α及il-1β测试结果图；
其中，a为25μm苯醌亚胺衍生物il-1α测试结果；b为25μm苯醌亚胺衍生物il-1β测试结果；
图9为本发明实施例合成的四种苯醌亚胺衍生物的蛋白质印迹实验结果图；
其中，a为flip及procaspase-3蛋白质印迹条带；b-1为flip蛋白的条带灰度值；b-2为pro-caspase3蛋白的条带灰度值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步地说明。
实施例1
称取450mg(3mmol，1eq)原料百里酚，置于25ml双口瓶内，加入1ml乙醇将其溶解，加入6ml38％浓盐酸，冰浴条件(0℃)下分批加入300mg(3.5mmol，1.2eq)nano3，冰浴(0℃)搅拌3h后室温(25℃)搅拌过夜。tlc跟踪反应，反应结束后倒入冰水中，调节ph值为7，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离，得黄色固体2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚(130mg，回收原料250mg，产率50％)。
反应方程式如下：
实施例2
称取389mg(8eq)氯化亚锡，放入25ml双口瓶中，加入3ml38％浓盐酸溶解，室温条件下(25℃)分批次加入50mg2-异丙基-5-甲基-4-硝基苯酚(0.25mmol，1eq)，逐渐升温至60℃，加入3ml乙醇，继续升温至80℃搅拌3h。tlc跟踪反应，待反应完全后，倒入冰水中，调节ph值为7，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离，得粉色固体nbq’(38mg，产率90％)。
反应方程式如下：
实施例3
称取40mg(0.24mmol，1eq)nbq’，放入15ml双口瓶中，加入5ml弱酸性水溶液，室温下(25℃)分批加入27mg高锰酸钾(0.17mmol，0.8eq)，逐渐升温至60℃搅拌。tlc跟踪，待反应完全后调节ph值为7，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离，得黄色油状液体nbq(10mg，产率25％)。
反应方程式如下：
实施例4
称取75mg(0.45mmol，1eq)nbq’，放入25ml双口瓶中，用乙腈溶解，加入37μl碘乙烷(1eq)，95μl三乙胺(1.5eq)和1mgnai(0.1eq)，升温至110℃搅拌。tlc跟踪反应，反应结束后，加入水终止反应，分别用乙酸乙酯与10％hcl溶液、乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯与水萃取后，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离，得紫色固体enbq’(24mg，产率28％)。
反应方程式如下：
实施例5
称取36mg(0.21mmol，1eq)nbq’，放入15ml双口瓶中，用乙腈溶解，加入115mg(1.1eq)(4-溴丁基)三苯基溴化膦，120℃搅拌。反应结束后，加入水终止反应，柱层析分离，得黄棕色固体pnbq’(产量：64mg，产率52％)。
反应方程式如下：
实施例6
将raw264.7细胞接种到六孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞密度达到80％以上，分别加入25μm四种苯醌亚胺衍生物预处理1h，然后加入lps(1μg/ml)共同孵育24h，最后加入atp3mm处理30min，取上清液用no试剂盒测试。
从图6的结果图中看出，lps及atp的加入促使了细胞内no含量的升高。因巨噬细胞在炎症刺激下会激活诱导型一氧化氮合酶(inos)，从而产生大量no，从而对炎症的发生起到正向调节作用。而苯醌亚胺衍生物的加入使其含量显著地降低。表明苯醌亚胺衍生物能够有效地减少过量no的生成，从而在一定程度上减轻炎症反应的发生。
实施例7
将raw264.7细胞接种到共聚焦皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞密度达到80％以上，分别加入12μm四种苯醌亚胺衍生物预处理1h，然后加入lps(1μg/ml)共同孵育24h，利用激光共聚焦显微镜进行成像(488nm激发)。
从图7的结果图中看出，lps的加入大幅度提升了细胞内ros含量。因细胞受到外界促炎因子的刺激后，细胞内的氧化还原平衡被破坏，ros含量升高。苯醌亚胺衍生物有效地降低了细胞内ros的含量，表明苯醌亚胺衍生物能够在体内被还原成类似于氢化醌结构的对氨基苯酚而发挥抗氧化作用。
实施例8
将raw264.7细胞接种到六孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞密度达到80％以上，分别加入25μm四种苯醌亚胺衍生物预处理1h，然后加入lps(1μg/ml)共同孵育24h，最后加入atp3mm处理30min，取上清液用elisa试剂盒分别检测il-1α及il-1β的表达。
从图8的结果图中看出，lps及atp有效地诱导了raw264.7细胞炎症反应的发生，炎症因子il-1α及il-1β的表达显著升高，而苯醌亚胺衍生物处理后能够显著抑制炎症因子的释放，表明苯醌亚胺衍生物通过消除过量的ros而减轻了炎症反应的发生。
实施例9
将raw264.7细胞接种到6cm培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞密度达到80％以上，分别加入12μm四种苯醌亚胺衍生物预处理1h，然后加入lps(1μg/ml)共同孵育24h，收集细胞，提取蛋白质，利用sds-page凝胶电泳分离。利用pvdf膜进行转膜，一抗(flip和caspase-3)4℃孵育过夜，利用辣根过氧化酶(hrp)标记的二抗(anti-rabbitigg,hrp-linkedantibody)室温孵育1h，ecl发光，显影与定影。用图象处理系统分析目标条带的灰度值。
从图9的结果图中看出，苯醌亚胺衍生物能够有效地活化促凋亡蛋白caspase3的表达，表现为pro-caspase3的表达量显著降低，同时能够显著地抑制了抗凋亡蛋白flip的表达。表明苯醌亚胺衍生物能够有效地诱导炎症细胞的凋亡，去除炎症反应的效应细胞，表现出一定抗炎活性。