本发明涉及一种提高L-异亮氨酸产量的方法，属于微生物发酵
技术领域：
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背景技术：
：L-异亮氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，现已被广泛运于生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域。在国外，L-异亮氨酸还被其大量用于乳牛催乳、制备饲料添加剂以及生产功能饮料。目前，常用微生物发酵法生产L-异亮氨酸。而现有的L-异亮氨酸生产菌主要有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌，其中，除谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌外，其余均的产酸能力均十分低下，只有谷氨酸棒杆菌与黄色短杆菌的三分之一到二分之一。为提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等的产酸水平，已经有许多学者从菌株的角度，试图通过突变菌株、构建基因工程菌得到产酸水平提高的乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等。但是，由于突变菌株的正向突变率极低、基因工程菌的构建也具有不确定性，因此，急需找到新的提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等菌产酸水平的思路。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种提高L-异亮氨酸产量的方法。此方法是将发酵培养基中的传统氮源(如玉米浆等)替换为由豆饼粉、棉籽蛋白、麦芽汁、小麦胚芽粉以及干酪素按一定的比例配制而成的复合氮源以发酵生产L-异亮氨酸，此复合氮源可成功将以乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)发酵生产L-异亮氨酸的产量从13g/L提高到18g/L。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种提高L-异亮氨酸产量的方法，所述方法为将L-异亮氨酸生产菌株先接种于种子培养基中进行扩培，得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；所述发酵培养基中的氮源为复合氮源；所述复合氮源的成分包含豆饼粉、棉籽蛋白、麦芽汁、小麦胚芽粉以及干酪素。在本发明的一种实施方式中，所述豆饼粉、棉籽蛋白、麦芽汁、小麦胚芽粉以及干酪素的质量比为(3～4):(0.5～1):(2～3):(2～3):(1～2)。在本发明的一种实施方式中，所述豆饼粉、棉籽蛋白、麦芽汁、小麦胚芽粉以及干酪素的质量比为3:0.5:2:3:1.5。在本发明的一种实施方式中，所述麦芽汁的浓度为20％～35％；麦芽汁浓度是指开始发酵时麦芽汁的糖度。在本发明的一种实施方式中，所述麦芽汁的浓度为25％；麦芽汁浓度是指开始发酵时麦芽汁的糖度。在本发明的一种实施方式中，所述L-异亮氨酸生产菌株为乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含葡萄糖90～100g/L、硫酸铵12～20g/L、玉米浆90～100g/L、磷酸二氢钾3～4g/L以及硫酸镁1～2g/L。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为6～7。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为6.8。在本发明的一种实施方式中，所述扩培的条件为温度29～33℃、时间14～20h、转速200～300rpm。在本发明的一种实施方式中，所述扩培的条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖2350～3000g/L、硫酸铵0～400g/L、复合氮源500～750g/L、磷酸二氢钾0～20g/L、硫酸镁0～10g/L。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖2750g/L、硫酸铵280g/L、复合氮源650g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁5g/L。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6～8。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6.7。在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度27～36℃、时间60～80h、转速100～150rpm。在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm。本发明提供了应用上述一种提高L-异亮氨酸产量的方法生产得到的L-异亮氨酸。本发明提供了上述一种提高L-异亮氨酸产量的方法在生产L-异亮氨酸方面的应用。有益效果：本发明将发酵培养基中的传统氮源(如玉米浆等)替换为由豆饼粉、棉籽蛋白、麦芽汁、小麦胚芽粉以及干酪素按一定的比例配制而成的复合氮源以发酵生产L-异亮氨酸，此复合氮源可成功将以乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)发酵生产L-异亮氨酸的产量从13g/L提高到18g/L。具体实施方式下面结合实施例与对比例，对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的培养基如下：种子培养基：葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L，pH6.8发酵培养基：葡萄糖2750g/L、硫酸铵280g/L、复合氮源650g/L、磷酸二氢钾15g/L以及硫酸镁5g/L，pH6.7下述实施例中涉及的检测方法如下：L-异亮氨酸产量的检测方法如下：纸层析法：1、点样：用微量定样器，按纸色谱法检查，点样1μL，展开剂为正丁醇：冰醋酸：水＝5:2:1；2、展开：展开时间≥3h，结束后晾干色谱滤纸；3、茚三酮显色：将晾干后的色谱滤纸在盛有2％茚三酮显色剂的瓷托盘中浸润，风干后置105℃烘箱中干燥5min即呈现蓝紫色斑点，按大小一致的面积剪下显色斑点，洗脱；4、洗脱：将剪下的色斑置于具塞试管中用洗脱剂(75％乙醇：0.2％Cu5SO4·5H2O＝39:1)，各5ml进行洗脱；5、吸光度测定：取洗脱液在520nm处测定吸光度，根据吸光度在标准曲线上查出相应的含量；6、标准曲线绘制：根据发酵液的实际产酸率，选取相应的5个浓度的梯度标准样，同样品液一起点样、展开、显色、洗脱，测定520nm处吸光度，以标准样为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。实施例1具体步骤如下：(1)按照表1的配方配置复合氮源；(2)将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；(3)将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL含有不同复合氮源的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，检测结果如表2。表1复合氮源配方豆饼粉(g/L)棉籽蛋白(g/L)麦芽汁(g/L)小麦胚芽粉(g/L)干酪素(g/L)A1953513019595B1956513019565C1953519513095D2303514015095E1907013019070F18080160130100G18090140130110H15085120120100I200015015080J20040180180100其中，麦芽汁为浓度20％的麦芽汁。表2L-异亮氨酸产量检测结果L-异亮氨酸产量(g/L)A18.4B17.6C18.2D17.2E16.4F15.2G15.1H14.5I14.7J16.2对比例1将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装有100mL种子培养液中的250mL摇瓶中进行扩培，条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm，得到种子液；将种子液以0.2g/L的接种量接种于装有200mL含有以玉米浆为氮源的发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm，得到发酵液。将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测，L-异亮氨酸产量为13.2g/L。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3