利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产油脂的研究方法与流程

本发明涉及微藻生物处理
技术领域：
，具体涉及一种利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产油脂的研究方法。
背景技术：
：豆制品废水是一种典型的高浓度有机废水，是大豆在浸泡、制浆等加工过程中产生的。一般每加工1t大豆可产生废水7-10m3。豆制品废水适宜于生物方法处理。其污染物大都是可降解的有机物，可生化性达到0.6-0.7，适合微生物的生长。除pH较低外，豆制品废水的有毒有害物质很少。传统的脂质测定方法包括溶剂提取和重量分析法，这些方法工作量大、微藻用量多、耗时长，不利于高通量筛选。因此，快速简便的微藻油脂测定方法对微藻生物柴油的开发具有重要意义。但是，铜试剂法不能做到绝对定量，也需用称重法或标准脂肪酸进行标定。傅立叶变换红外光谱仪和气质联用彼均能实现微藻油脂的定量和定性分析，由于设备价格昂贵、实验成本较高，目前国内还很少有实验室能实现使用红外光谱仪和气质联仪用来进行微藻油脂的高通量筛选。尼罗红(NileRed，NR)是一种脂溶性的荧光染料，可以准确地将细胞内脂类物质与其他贮藏物区分开，因此经常被用于检测动物以及微生物细胞内油脂情况。尼罗红荧光染色溶液是一种旨在通过与脂类物质的结合并发出荧光检测信号，快速、敏感、可靠地活体定量测定细胞内脂类成分的常用荧光染料。尼罗红是一种脂溶性染料，能够与脂类物质相结合，性能稳定，着色清晰灵敏，选择合适的激发波长可以显示强烈橘红色荧光，适用于各种细胞的脂质染色。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产油脂的研究方法，豆腐废水中含有氮、磷、有机物等营养物质能被微藻利用，能够作为一种有效的有机废水来实现小球藻油脂生产并同时净化废水。本发明为解决上述
背景技术：
中的技术问题，提出的技术方案如下：利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产油脂的研究方法，包括如下步骤：1)小球藻接种：(1)将小球藻L166、L38分别接种于容器内；(2)添加BG-11培养基；(3)接种体积比为8-10.5％(V接种物/V培养基)；(4)置于光培养箱中培养7-10天：培养条件为温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx并通入0.5-1.0L.min-1的过滤灭菌空气条件下培养；2)废水预处理：(1)将豆腐废水离心、过滤并进行100-121℃高压灭菌处理；(2)将灭菌后的豆腐废水分别稀释10倍和100倍，向12个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml，每个稀释浓度设置6个样品；(3)调节pH为7-9；3)小球藻培养：在6个稀释10倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05；在6个稀释100倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05；培养条件为：温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx；4)小球藻油脂的测定。所述步骤4)小球藻油脂的测定具体步骤如下：(1)培养20-25天后，取2.55mL不同稀释倍数豆腐废水培养下的小球藻L166和L38藻液，添加450μL二甲基亚砜(DMSO)及1mg/mL溶于丙酮的尼罗红(NR)溶液24μL；(2)在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀；(3)在30℃暗室静置10min；(4)选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定，根据荧光值查找标准曲线计算油脂生产率(mg/L/d)所述步骤2)中豆腐废水原始水质：化学需氧量22.7±0.74g/L，总氮0.95±0.05mg/L，总磷0.12±0.007g/L。与现有技术相比，本发明具有的优点：本发明通过20-25d的豆腐废水培养之后，在稀释10倍的废水中培养更利于两株小球藻L166和L38的油脂生产，其中L166小球藻油脂生产率最高，达7.22mg·L-1·d-1；本发明将高浓度的豆腐废水作为小球藻的培养基质，不仅提供了充足的营养物质促进小球藻的生长及高值化学品的积累，同时也实现了废水的利用与净化，是一种高效环保的培养模式。附图说明图1是尼罗红染色法测定油脂的标准曲线；图2是在稀释10倍及100倍豆腐废水中培养的小球藻L166和L38的油脂生产率。具体实施方式下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。本发明利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产油脂的研究方法，包括如下步骤：1)小球藻接种：(1)将小球藻L166和L38分别接种于容器内；(2)添加BG-11培养基；(3)接种体积比为8-10.5％(V接种物/V培养基)；(4)置于光培养箱中培养7-10天：培养条件为温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx并通入0.5-1.0L.min-1的过滤灭菌空气条件下培养；上述步骤1)中(2)所述的BG-11培养基组成为下表1所示：表1BG-11培养基成分及含量名称浓度/(mg.L-1)名称浓度/(mg.L-1)NaNO31500Na2CO3.10H2O54K2HPO4.3H2O52.4MgSO436.6CaCl2·2H2O36柠檬酸6Na2EDTA1.0柠檬酸铁5.5H3BO32.86ZnSO4·7H2O0.22Na2MoO4.2H2O0.39MnCl2.4H2O1.86Co(NO3)2·6H2O0.049CuSO4·5H2O0.0792)废水预处理：(1)将豆腐废水离心、过滤并进行100-121℃高压灭菌处理；(2)将灭菌后的豆腐废水分别稀释10倍和100倍，向12个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml，每个稀释浓度6个样品；具体详见表2为实施例1至12中12个样品工艺条件；(3)调节pH为7-9；其中，豆腐废水原始水质：化学需氧量(COD)22.7±0.74g/L，总氮(TN)0.95±0.05mg/L，总磷(TP)0.12±0.007g/L；3)小球藻培养：在6个稀释10倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05；在6个稀释100倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05；培养条件为：温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx；4)尼罗红荧光染色法标准曲线的绘制：取5.5μL三油酸甘油酯溶于1ml吡啶中，配成浓度为5.0325mg/mL的标准液；分别取0、3、6、12、30、36、45μL标准液加水稀释至2.55mL，再加入二甲基亚砜(DMSO)450μL及24μL溶于丙酮的1mg/mL尼罗红(NR)溶液；在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀，然后在30℃暗室静置10min；如图1所示，选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定，绘制荧光值与油脂浓度的标准曲线；5)小球藻油脂的测定：培养20-25天后，取2.55mL不同稀释倍数豆腐废水培养下的小球藻L166和L38藻液，添加450μL二甲基亚砜(DMSO)及1mg/mL溶于丙酮的尼罗红(NR)溶液24μL；在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀，然后在30℃暗室静置10min；选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定；根据荧光值查找标准曲线计算油脂生产率：油脂生产率(mg/L/d):本发明下面的12个具体实施例按照上述步骤1)至步骤5)进行，实施例1至实施例12工艺参数见表2：表2实施例1至12工艺参数如图2所示，为20-25d的豆腐废水培养之后，在稀释10倍和100倍的废水中培养表现，可以看出稀释10更利于两株小球藻L166和L38的油脂生产，其中L166小球藻油脂生产率最高，达7.22mg·L-1·d-1；本发明将高浓度的豆腐废水作为小球藻的培养基质，不仅提供了充足的营养物质促进小球藻的生长及高值化学品的积累，同时也实现了废水的利用与净化，是一种高效环保的培养模式。应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。相关文献：[1]陈洪斌,高廷耀,唐贤春.豆制品废水生物处理的研究与应用进展[J].中国沼气,2000,(3):13.DOI:10.3969/j.issn.1000-1166.2000.03.003.[2]石玉新,穆迪,武洪庆,等.微藻油脂含量的几种快速测定方法[J].安徽农业科学,2012,(21):11067-11069.DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2012.21.112.[3]石健,张雯婕,冯汛,等.尼罗红荧光染色法的优化及应用[J].工业安全与环保,2016,(4):61-64.DOI:10.3969/j.issn.1001-425X.2016.04.019。当前第1页1 2 3