一种Pdzd7基因突变动物模型的构建方法与流程

本发明属于利用基因修饰技术制作基因突变动物模型
技术领域：
，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法。
背景技术：
：CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShotPalindromicrepeats/CRISPR-associated)系统是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫系统，在细菌和古生菌中CRISPR系统整合侵入宿主的噬菌体或者质粒DNA的片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPRRNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas系统分为3种类型(TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ)，其中TypeⅡ系统因其简单、高效以及功能多样化等优点，自2013在哺乳动物细胞中成功实现基因编辑后，现已被广泛用于多种模式生物的基因组修饰技术应用中。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。CRISPR/Cas9系统相关载体构建简单快速，便于操作，实验周期较短，且广泛适用于多个物种。在基因编辑的过程中，CRISPR/Cas9系统需要一段特殊的引导RNA，即sgRNA(singleguideRNA)，sgRNA的序列选择限制性较小，只需要基因组序列中出现PAM(NGG)区即可。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，继而引发细胞的自主修复，修复的过程可以是随机的片段缺失或插入，也可以利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。Usher综合征(Ushersyndrome,USH)是一种能够引起视觉和听觉双重感官障碍的遗传性疾病，在目前已知的超过50种的视力下降合并听力受损的综合征中，以Usher综合征最为常见，该病的全球发病率为1/6000～1/10000。USH为常染色体隐性遗传病，其特征表现为视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)和感音神经性耳聋(sensorineuralhearingloss,SNHL)。USH在临床上分为3种类型，都存在因视网膜色素变性而引起的进行性视力下降，区别在于听力和前庭功能的变现各不相同。其中USH1型最为严重，临床变现有先天性耳聋、严重的听力损失，因听力障碍导致的语言发育迟缓；此类患者还经常伴有前庭功能障碍，患儿学会独立行走的时间较同龄儿童晚。Usher2型患者听力损失较轻，为中到重度耳聋，但前庭功能正常。USH3型以渐进性听力损失为特点，伴随不同程度的前庭功能失调。此外，部分Usher综合征患者还可能伴有智力衰退、嗅觉丧失、癫痫等神经系统病变。PDZD7作为一个重要的耳聋基因，其编码蛋白是听觉感受细胞顶端听纤毛踝连接的组成成分，突变能够引起综合征型或非综合征型听力丧失。PDZD7基因有多个转录剪切本，编码不同的PDZD7蛋白亚型，其中长型PDZD7蛋白包含有三个重要的、能够介导蛋白质之间相互作用的结构域，即PDZ结构域，短型PDZD7只含有前两个PDZ结构域。目前常见的PDZD7突变大多影响长型PDZD7。在小鼠中模拟相关耳聋突变，构建Pdzd7基因突变小鼠模型，对PDZD7突变致聋机制进行深入探讨，并利用这一模型进行药物筛选，具有重要的临床意义。但检索发现目前虽有Pdzd7基因敲除小鼠，但没有仿真模拟人相关耳聋突变的、只影响长型PDZD7的小鼠模型，因此建立一种构建只影响长型PDZD7的基因突变动物模型的方法意义重大。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法。本发明所述基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法，步骤是：(1)在小鼠Pdzd7基因11号外显子上p.C728LfsX18致病突变位点附近设计合适的GuideRNA；其中引物GuideRNAtargetsite1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，引物GuideRNAtargetsite2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(2)体外合成GuideRNA和Cas9mRNA；(3)将合成后的GuideRNA和Cas9mRNA等摩尔比配制成100ul注射样品，将样品注射到取自C57BL/6J母鼠受精卵的雄原核中，培养恢复后移植入假孕受体小鼠，等待获得F0代小鼠；(4)利用PCR反应体系对获得的F0代小鼠进行鉴定；(5)将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J交配获得F1代小鼠，即为Pdzd7基因突变小鼠模型。上述基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法中：步骤(2)所述GuideRNA和Cas9mRNA体外合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。上述基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法中：步骤(4)所述PCR反应体系的引物为Pdzd7-test-F3和Pdzd7-test-R3；其中Pdzd7-test-F3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，Pdzd7-test-R3的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本发明公开的基于CRISPR/Cas9技术的Pdzd7基因突变动物模型的构建方法能够成功获得与人类中p.C732LfsX18致病突变相近的Pdzd7基因突变小鼠模型。方法中涉及的设计并挑选合适的靶向小鼠Pdzd7基因的GuideRNA，难点在于寻找728位Cysteine附近合适的sgRNA以实现能够模拟人类p.C732LfsX18突变的效果。本发明的构建方法为获得与人类Pdzd7基因p.C732LfsX18致病突变相近的小鼠模型提供了便利，为研究人类中PDZD7耳聋突变的相关因素和诊断治疗提供了基础。附图说明图1、Pdzd7基因突变小鼠构建策略图及基因鉴定引物设计。图2、F0代阳性小鼠PCR产物测序结果比对。具体实施方式如下实施例使用的Taq酶及PCR相关试剂购自TaKaRa公司。化学试剂主要购自Sigma和上海化学试剂公司。胶回收Kit，质粒抽提Kit购于Qiagen公司。RNA合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物合成自英潍捷基(上海)贸易有限公司。实施例1：基于CRISPR/Cas9技术构建Pdzd7基因突变动物模型的构建方法通过以下步骤实现：(1)靶向小鼠Pdzd7基因的GuideRNA的选择和设计设计Pdzd7基因突变小鼠构建策略，如图1所示。根据构建策略，在Pdzd7基因相应的位置设计合适的GuideRNA，其中GuideRNAtargetsite1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，GuideRNAtargetsite2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体序列如下：sgRNA名称序列PAMGuideRNAtargetsite1ACAGGAGGTGGCTGGGGAGGAGGGuideRNAtargetsite2GAGGAGGTGCGCATGCGCCTGCC(2)体外合成GuideRNA和Cas9mRNAGuideRNA和Cas9mRNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(3)受精卵显微注射制备F0代小鼠1)单细胞受精卵的获得小鼠超排：第一天，为C57BL/6J小鼠腹腔注射马绒毛膜促性腺激素5IU/只，46-48小时后注射人绒毛膜促性腺激素，注射完人绒毛膜促性腺激素后将2只雌鼠与单放雄鼠1只合笼。第四天上午检栓，见栓的记为0.5天。获取受精卵：将见栓0.5天后的小鼠脱颈处死，取出输卵管，在解剖镜下小心取出成团的卵子并用透明质酸酶消化，挑取形态饱满且胞质均匀的胚胎放置于M16培养液中培养。2)显微注射受精卵将挑选后的受精卵转移入M2条带中依次排列(30-50枚左右)。提前将合成后的GuideRNA和Cas9mRNA等摩尔比共同配制成100ul注射样品，待注射管刺入受精卵后匀速将样品注入，见到胞质松散后迅速退针。注射结束后，将受精卵移入M16培养液中，并于37℃、5％二氧化碳培养箱中恢复0.5-1小时。将注射后的受精卵移植到E0.5天假孕小鼠体内。移植后大约19-21天生出F0代小鼠。(4)利用PCR反应体系对获得的F0代小鼠进行鉴定1)F0代小鼠基因组制备F0代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400ul裂解液及40ul蛋白酶K(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100ul纯水中，50℃烘箱助溶1小时。2)F0代小鼠基因型鉴定以制取的F0代小鼠基因组为模板使用TaKaRaLataq扩增鉴定片段，引物为Pdzd7-test-F3和Pdzd7-test-R3，如图1所示，可扩增出1.5kb条带。其中，Pdzd7-test-F3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，Pdzd7-test-R3的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。Pdzd7-test-F3：5’-GGGGCGGGCGGGGACTT-3’Pdzd7-test-R3：5’-CATGGGCTGCACCTTGGACTCG-3’反应条件为98℃2min变性后，98℃10s，68℃60s，进行34个循环，68℃延伸2min，PCR体系参见TaKaRa说明书。1％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收1.5kb条带，分别连接pGEM-T载体(Promega)，转化，每个平板挑取6个单克隆测序鉴定，引物为Pdzd7-test-F3。测序结果显示有2bp碱基缺失，如图2所示。(5)将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J交配获得F1代小鼠，筛选出的阳性F1代小鼠即为Pdzd7基因突变动物模型小鼠。阳性F0代小鼠在8周龄左右性成熟后和野生型C57BL/6J回交进行配繁，得到F1小鼠。同F0代相似，待小鼠出生14天后，剪尾进行PCR鉴定，得到F1代杂合子。筛选出的阳性F1代小鼠即为Pdzd7基因突变动物模型小鼠。序列表<110>山东大学<120>一种Pdzd7基因突变动物模型的构建方法<141>2018-6-9<160>4<170>PatentInVersion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>小鼠<222>（1）…（20）<223>GuideRNAtargetsite1的核苷酸序列<400>1acaggaggtggctggggagg20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>小鼠<222>（1）…（20）<223>GuideRNAtargetsite2的核苷酸序列<400>2gaggaggtgcgcatgcgcct20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>小鼠<222>（1）…（17）<223>引物Pdzd7-test-F3的核苷酸序列<400>3ggggcgggcggggactt17<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>小鼠<222>（1）…（22）<223>引物Pdzd7-test-R3的核苷酸序列<400>4catgggctgcaccttggactcg22当前第1页1 2 3