一种改变通气条件调控产物的多细胞体系及发酵方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种以粗甘油为底物，通过改变通气条 件，柔性调控多细胞体系组成，从而实现不同产物的调控生产。

背景技术：

生物炼制是以生物可再生资源为原料生产能源与化工产品的新型工业模式，被认 为是创造新的生物基产业的最有发展前景技术。细胞工厂是实现生物化学转化的基础。 然而，自然界中任何一种微生物的酶系种类有限，转化效率与能力有限，不能满足工 业生产的需要。要将微生物改造成用于生物炼制的细胞工厂，必须借助基因组学、系 统生物学和高速计算技术的最新发展，解析微生物的基因、蛋白、网络与代谢过程的 本质，在分子、细胞和生态系统尺度上，多水平、多层次地认识和改造微生物，经过 人工控制的重组和优化，重新分配微生物细胞代谢的物质流和能量流，高效地制备生 物能源和替代石油化工原料的平台化合物(马延和，生物工程学报，2010，26(10)； 1321-1326)。构建高效细胞工厂是生物炼制的核心技术，它的发展将推动生物炼制逐 步取代传统石油炼制，解决人类面临的日趋严峻的能源、资源和环境问题。

本发明通过微生物不同细胞的柔性组合，可从细胞尺度上构建不同的多细胞工厂， 经过人工控制的重组和优化，重新分配微生物细胞代谢的物质流和能量流，高效地制 备平台化合物。本发明中涉及到的生物基产品为1,3-丙二醇、乳酸及丁酸，三者在不 同的领域有着广泛的应用。1,3-丙二醇作为一种重要的三碳平台化合物，广泛应用于 工业、食品和医药卫生等领域，同时也是聚酯、聚醚和聚亚安酯等聚合物的合成前体。 在众多聚合物中，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)作为一种新型可降解纤维，早在1998 年，便被美国认定为六大石化新产品之一，随着PTT等新型可降解塑料的市场需求不 断提升，1,3-丙二醇作为其不可或缺的合成前体，市场前景亦是十分广阔。据国际著 名市场调研公司Markets and Markets公司发布的最新研究报告显示，1,3-丙二醇市场 容量预计在2014-2021年间将以10.4％的年复合增长率增长，在2021年将达到6.21亿 美元。乳酸(Lactic acid)是重要的生物化工产品，广泛用于医药、食品、饮料、化工、 皮革、卷烟工业等领域。乳酸最具前景的应用是以聚乳酸(PLA)为代表的生物材料 领域。作为最有潜力的可生物降解高分子材料，有望代替聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯 等不可降解的塑料，消除“白色污染”，是一种极具应用潜力的生物环保材料。丁酸是 一种重要的合成香料以及其他精细化工产品的原料，主要用于丁酸酯类和纤维素丁酸 酯的合成。

生物基化学品如1,3-丙二醇、乳酸、丁酸等主要的生产方法有化学合成法和微生 物转化法，相比较而言，微生物转化法因其绿色、环保、可持续，符合当前国际社会 绿色发展的理念而备受国内外学者青睐(Zeng AP et al.,Current Opinion in Biotechnology,2011；22:749-757)。但微生物转化生产生物基化学品目前也面临着生产 成本高、菌株底物耐受性差等问题，因此构建高效细胞工厂尤为重要，也是实现生物 炼制的核心重点技术。以1,3-丙二醇生产为例，其底物成本约占1,3-丙二醇生产成本 的50％。截止到目前为止，能够被自然界中微生物直接利用且转化生产1,3-丙二醇的 底物只有甘油，若以生物柴油副产物粗甘油为底物来生产1,3-丙二醇不仅可以降低其 生产成本，也能够解决粗甘油过剩的问题，提高约30％的税后净利润(牟晓佳等，过 程工程学报，2009 9(5):947-952)。但是粗甘油自身成本比较复杂(甲醇、盐、游离脂 肪酸等)，毒性物质含量较高，对菌体的生长代谢有一定的抑制作用。就菌株底物耐 受性问题而言，目前能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的微生物主要集中在肠杆菌属 (Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Citrobacter)、乳酸杆菌 属(Lactobacilli)和梭菌属(Clostridia)等)。丁酸梭菌(Clostridia butyricum)和肺 炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)因其较高底物耐受性和转化率，得到了业内人士 较多关注和研究。其中，K.pneumoniae是一种兼性厌氧型菌株，易培养且生长速度快。 相对于丁酸梭菌而言，克雷伯菌属发酵生产1,3-丙二醇时需要加入微生素B12作为辅 酶，增加了原料成本，而且在其发酵生产1,3-丙二醇时，往往伴有2,3-丁二醇的产生。 因2,3-丁二醇和1,3-丙二醇沸点接近，10％的2,3-丁二醇副产物的产生给后续1,3-丙二 醇的分离纯化增加了难度和成本。C.butyricum是一种严格厌氧的菌株，对培养条件要 求较为严格，生长速率相对较低，已有的研究表明C.butyricum DSM 5431在批次发 酵时可耐受底物浓度为110g/L，1，3-丙二醇产量达56g/L(Biebl H et al.,Applied Microbiology&Biotechnology,1992,36:592-597)。由于发酵过程中需要采用制氮设备 用以维持厌氧环境，增加了固定设备的投资及能耗。

近年来，随着微生物组学的兴起，测序技术的突破，人们可以对环境中的微生物 的种类和丰度进行实时检测。得益于此，在给予一定的自然选择压力后，将能够利用 复杂基质的微生物保留在反应器中，通过微生物菌群间的相互作用来实现目标产物发 酵生产的理念，正逐渐引起国内外学者的关注。通过微生物不同细胞的柔性组合，可 从细胞尺度上构建不同的多细胞工厂，经过人工控制的重组和优化，重新分配微生物 细胞代谢的物质流和能量流，高效地制备平台化合物。CN 104774879公开了一组主 要由K.pneumoniae组成的兼性厌氧型微生物菌群。最高可耐受到200g/L甘油,1,3- 丙二醇产量达81.40g/L，生产强度为0.99g/(L.h)。CN 106399204公开了一组主要由 C.butyricum组成的严格厌氧型微生物菌群，最高可耐受120g/L甘油，1,3-丙二醇产 量为60.61g/L，转化率为0.52g/g。在此菌群中，梭菌属占总有效活菌数的99.98％， C.butyricum的占比高达97.36％，菌群多样性趋于单一化。已有的微生物菌群产物相 对稳定，只针对一种目标产物。为了充分利用微生物多样性以及菌群之间的相互作用 关系，开发一种复杂底物耐受性强，发酵性能好，生产强度高，柔性调控多细胞体系 组成，从而实现不同产物的调控生产的多细胞体系及其发酵方法，对于高效提高大宗 工业原料的生物合成能力，形成先进生物炼制技术的基础具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种在微氧/厌氧条件下发酵性能稳定，耐受性强，可高效 转化粗甘油为1,3-丙二醇、乳酸和丁酸的多细胞体系以及利用该多细胞体系制备1,3- 丙二醇、乳酸和丁酸的方法，通过改变通气条件，柔性调控多细胞体系组成，从而实 现不同产物的调控生产。本发明的多细胞体系由厌氧的梭状芽胞杆菌属和兼性的克雷 伯氏菌属及埃希氏杆菌属组成，其发酵性能稳定，复杂底物耐受性强，在微氧/厌氧条 件下可高效转化粗甘油为1,3-丙二醇、乳酸和丁酸，克服丁酸梭菌单菌发酵需要维持 严格厌氧环境的局限。

本发明的技术方案首先公开一种用于以粗甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇、乳酸 和丁酸的多细胞体系，所述的多细胞体系包括厌氧的梭状芽孢杆菌属菌株、兼性的克 雷伯杆菌属菌株及埃希氏杆菌属菌株，所述厌氧的梭状芽孢杆菌属菌株、兼性的克雷 伯杆菌属菌株及埃希氏杆菌属菌株的总有效活菌数占多细胞体系中有效活菌数的97％ 以上，所述的梭状芽孢杆菌属菌株和克雷伯杆菌属菌株及埃希氏杆菌属菌株的有效活 菌数比例为60～90:5～40:1～10。进一步地，所述梭状芽孢杆菌属(Clostridium)菌株为 丁酸梭菌Clostridium butyricum，所述的克雷伯杆菌属(Klebsiella)菌株为克雷伯肺炎杆 菌Klebsiella pneumonia，所述埃希氏杆菌属(Escherichia)菌株为大肠杆菌Escherichia coli。

进一步地，在所述的多细胞体系中，所述的丁酸梭菌、克雷伯肺炎杆菌和大肠杆 菌的有效活菌数比例为60～70:30～40:1～5。

进一步地，在所述的多细胞体系中，所述的丁酸梭菌、克雷伯肺炎杆菌和大肠杆 菌的有效活菌数比例为65.33:31.52:1.70

在本发明中，所述的丁酸梭菌和克雷伯肺炎杆菌和大肠杆菌均为本领域常规使用 的菌株，在本申请给出的各菌株间比例关系范围内，由所述菌株组成的混合菌群，其 发酵性能稳定，在微氧/厌氧条件下高效转化粗甘油为1,3-丙二醇、乳酸和丁酸，发酵 过程克服了丁酸梭菌单菌发酵需要严格厌氧环境、粗甘油耐受性低，生产强度低等局 限。

其中，本发明所述的微氧条件是指不通氮气条件。

本发明另一方面提供一种微氧/厌氧发酵生产1,3-丙二醇的发酵方法，该发酵方法 包括将上述多细胞体系接入到以粗甘油为底物的发酵培养基中进行发酵，所述粗甘油 中甘油含量为65％～80％。

进一步地，在上述发酵方法中，所述的粗甘油是未经处理的生物柴油副产物或油 脂水解产物。优先的，所述粗甘油是未经处理的油脂水解产物。粗甘油作为油脂厂的 副产物，可用于微生物发酵。其组成为(w/v)：65％～80％甘油，15％～17％水，0.87％ 灰分，0.1％游离脂肪酸，以及少量的色素和杂质。

进一步地，在上述发酵方法中，发酵过程中发酵培养基和发酵设备都不灭菌。

进一步地，在上述发酵方法中，在微氧/厌氧条件下，将所述的多细胞体系接入到 40-140g/L的甘油为底物的发酵培养基中进行间歇或批式流加发酵。本发明多细胞体 系在100～140g/L甘油，尤其是在140g/L甘油中也能生长代谢，具有高生产强度和 1,3-丙二醇转化率。

进一步地，在上述发酵方法中，发酵过程中氮气通气量为0-～0.2vvm。

采用本发明的混合菌群，无N2条件下，初始甘油浓度为120g/L批式发酵，发酵 产物以1,3-丙二醇和乳酸为主，其中1,3-丙二醇的最终浓度为43.20g/L，质量转化率 为0.39g/g，生产强度为0.98g/(L.h)；乳酸浓度为26.38g/L，二者总的质量转化率为 0.63g/g。其它代谢副产物为乙酸、丁酸、琥珀酸和甲酸，分别为8.94g/L、2.73g/L、 3.24g/L和4.71g/L。

所述发酵过程中当氮气通气量不为0通气时(实施例中的N2通入量为0.2vvm)， 接种前后分别通气1h和2h，初始甘油浓度为120g/L批式发酵，发酵产物以1,3-丙 二醇、丁酸和乙酸为主。1,3-丙二醇的最终浓度可达到61.49g/L，转化率高达0.55g/g， 生产强度为2.46g/(L·h)；丁酸和乙酸分别为7.79g/L和7.44g/L；乳酸含量大幅度降 低，仅为3.56g/L。

本发明相对于现在技术有以下有益效果：

(1)本发明公开了一种利用粗甘油发酵制备1,3-丙二醇、乳酸和丁酸的多细胞体 系，其发酵稳定性好，复杂底物耐受性强，生产强度高。

(2)本发明微生物菌群中含有严格厌氧的丁酸梭菌和兼性肺炎克雷伯氏杆菌及大 肠杆菌，三者可在微氧/厌氧条件互利共生，通过调控通氧条件，可实现高效转化工业 废弃物粗甘油生产1,3-丙二醇、乳酸和丁酸，不仅有效地降低了原料成本，还减少了 制氮设备的投资和能耗。

(3)与传统的厌氧微生物丁酸梭菌纯种发酵相比，本发明提供的多细胞体系具有 较高的底物耐受能力和1,3-丙二醇生产能力。

附图说明

图1多细胞体系富集筛选传代过程甘油、1,3-丙二醇及代谢副产物变化情况；其 中，图1A为多细胞体系富集筛选传代过程中残余甘油、细胞生长、接种时间及接种 体积随传代次数增加的变化曲线。结果说明该多细胞体系在传代至中后期时，菌体的 生长及底物的消耗趋于稳定。图1B为代谢产物1,3-丙二醇、丁酸、乙酸和乳酸随传代 次数增加的变化曲线，结果说明该多细胞体系在传代至中后期时，产物生成趋于稳定， 获得生产稳定的多细胞体系。

图2多细胞体系DUT08微氧/厌氧发酵代谢特性及底物耐受情况(A:0.0vvm N2； B:0.02vvm N2)；其中，图2A为在不同底物浓度下，多细胞体系DUT08微氧(不通 N2)批式发酵甘油消耗、细胞生长及1,3-丙二醇生成随时间变化曲线。结果说明在不 通N2条件下，DUT08最高可耐受120g/L甘油，发酵产物主要以1,3-丙二醇和乳酸为 主。图2B为在不同底物浓度下，多细胞体系DUT08厌氧(0.02vvm N2)批式发酵甘 油消耗、细胞生长及1,3-丙二醇生成随时间变化曲线。结果说明在N2通入量为0.02vvm 时DUT08具有更高的底物耐受性，可在甘油含量为140g/L的粗甘油中生长代谢，代 谢产物以1,3-丙二醇、丁酸和乙酸为主。

图3多细胞体系DUT08在不同N2通入量时生长及代谢情况；结果说明随着通气 量的增加，多细胞体系DUT08发酵生产1,3-丙二醇的能力逐渐提高，代谢副产物乳 酸的量降低，代谢流更多的流向丁酸和1,3-丙二醇，表明肺炎克雷伯氏杆菌代谢甘油 途径减慢，主要以丁酸梭菌为主利用甘油代谢途径，产生丁酸作为主要代谢副产物。

图4厌氧多细胞体系DUT08-C批式发酵生长及代谢情况(120g/L甘油)；结果说 明DUT08-C的1,3-丙二醇生产能力相对于DUT08而言降低，代谢副产物主要是丁酸 和乙酸。多细胞体系DUT08中的其它菌如克雷伯氏杆菌和大肠杆菌对丁酸梭菌代谢甘 油生产1,3-丙二醇具有协同促进作用。

图5厌氧菌Clostridium butyricum DUT1批式发酵生长及代谢情况(120g/L甘油)； 结果说明单菌C.butyricum DUT1转化粗甘油的能力与由羧菌属组成的微生物菌群 DUT08-C的生产能力相似，和多细胞体系DUT08相比，该菌株的1,3-丙二醇产量下 降了20.65％，发酵时间延长了21h，生产强度下降了56.91％。

图6兼性菌Klebsiella pneumonia DUT2微氧/厌氧批式发酵生长及代谢情况(120 g/L甘油)。其中，图6A为K.pneumonia DUT2微氧(不通氮气)批式发酵甘油消耗、 细胞生长及产物生成随发酵时间变化曲线，结果说明微氧条件下，K.pneumonia DUT2 产生更多的乳酸，乳酸含量相当于厌氧条件，增加了21.75％。图6B为K.pneumonia DUT2厌氧(0.2vvm N2)批式发酵甘油消耗、细胞生长及产物生成随发酵时间变化 曲线，结果说明微氧和厌氧条件下，K.pneumonia DUT2表现出来代谢甘油的能力非 常相似。而微氧条件更有利于K.pneumonia DUT2的生长代谢，其在多细胞体系DUT08 代谢甘油生产1,3-丙二醇过程中，一方面为Clostridium butyricum DUT1生长代谢提供 了厌氧环境，一方面与Clostridium butyricum DUT1一起代谢甘油生产1,3-丙二醇。二 者的合作，最终实现多细胞体系DUT08高效转化粗甘油生产1,3-丙二醇。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方 法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。

1、下述实施例使用的培养基：

富集培养基(g/L)：酵母浸粉1.0,粗甘油(75％)28.0,KH2PO4 1.3,K2HPO4·3H2O 4.454,(NH4)2SO4 2.0,MgSO4·7H2O 0.2,CaCO3 2.0,CaCl2 0.02,Fe²⁺(FeSO4·7H2O 5g, HCl 4mL)1mL/L,微量元素A溶液(饱和盐酸0.9mL，CuCl2·2H2O 0.02，ZnCl2 0.07， MnCl2·4H2O 0.1，H3BO3 0.06，CaCl2·6H2O 0.2，NiCl2·6H2O 0.025，NaMoO4·2H2O 0.035)2ml/L.

种子培养基(g/L)：酵母浸粉1.0，粗甘油(75％)28.0，KH2PO4 1.3， K2HPO4·3H2O 4.454，(NH4)2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCO3 2.0，CaCl2 0.02， Fe²⁺(饱和盐酸4mL，FeSO4·7H2O 5g)1mL/L，微量元素A溶液(饱和盐酸0.9mL， CuCl2·2H2O 0.02，ZnCl2 0.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO3 0.06，CaCl2·6H2O 0.2， NiCl2·6H2O 0.025，NaMoO4·2H2O 0.035)2mL/L。

固体培养基(g/L)：种子培养基中加入琼脂粉15g。

发酵培养基：酵母浸粉2.0，粗甘油(75％)40-140，KH2PO4 1.36，(NH4)2SO4 6.61，MgCl·6H2O 0.26，CaCO3 10.0，CaCl2 0.29，微量元素B溶液(CuCl2·2H2O 0.47， ZnCl20.68，MnCl2·4H2O 0.17，H3BO3 0.06，NaMoO4·2H2O 0.005，FeCl2·4H2O 3.97， CoCl2·6H2O 0.47，饱和盐酸10mL)5mL/L，pH＝7.0。

2、种子培养：

厌氧培养：采用250mL西林瓶，装液量100mL。待装入培养基后每瓶持续通3min 氮气除氧，之后用丁基胶塞封顶，121℃灭菌20min。实验过程中用一次性无菌针管接 种及取样，接种量5％(v/v)，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间12-24h。

微氧培养。采用250mL锥形瓶，装液量100mL。待装入培养基后用棉塞封顶， 121℃灭菌20min。实验过程中用一次性无菌针管接种及取样，接种量5％(v/v)，培 养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间12-24h。

3、发酵培养条件：

采用5L全自动发酵罐，装液量2L，将种子培养的产物以接种量10％(v/v)接种 至发酵培养基中，以粗甘油为底物，在发酵罐温度37℃、转速200r/min下发酵，发 酵过程用5M NaOH控制pH为7.0。通气0-0.2vvm，接种前后分别通气1h和2h。

粗甘油：油脂水解的产物，组成为(w/w)：78％甘油、15～17％水、0.87％灰分、 0.1％游离脂肪酸，pH 6.91。

实施例1 从石油废水中富集筛选驯化产1,3-丙二醇的多细胞体系DUT08

样品采集取自大连某石油废水处理厂，取10mL接入种子培养基中，在37℃， 200r/min培养至底物消耗过半(约30h)获得一级培养物。将一级培养物按5％接种 量转接另一种子培养基中，培养至底物消耗过半(约16.5h)获得二级培养物，将二级 培养物继续按5％接种量转接，转接时间缩短至12h，至此之后以12h为传代周期连 续传代至第35代，得到发酵性能稳定的多细胞体系。由图1A和1B可知，该多细胞 体系在传代至中后期(19-35代)时，菌体的生长、底物的消耗以及1,3-丙二醇的产量 (9.48-11.39g/L)和副产物丁酸、乙酸和乳酸的产量均趋于稳定。该多细胞体系经连 续35次的传代富集，其菌群结构亦趋于稳定。

经16S rRNA基因测序鉴定，该多细胞体系含有梭状芽孢杆菌属菌株(65.33％)、 克雷伯菌属菌株(31.52％)和埃希氏杆菌属菌株(1.70％)，其中百分比(％)表示各 菌属的有效活菌数占总有效活菌数的百分比。

多细胞体系DUT08经热激法，加热至90℃，15分钟，按10％接种量接种至种子 培养基中培养48h获得一级种子，将一级培养物继续按5％接种量转接，转接时间缩 短至24h，以24h为传代周期连续传代至第10代，后厌氧培养，得到多细胞体系 DUT08-C，从中挑取单菌落A1，16S rRNA测序鉴定为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)， 命名为Clostridium butyricum DUT1。

所述丁酸梭菌、肺炎克雷伯氏杆菌和大肠杆菌均为本领域常规使用的菌株。优选 的，所述丁酸梭菌可采用Clostridium butyricum DSM 10702，肺炎克雷伯氏杆菌可采用 Klebsiella pneumonia LX3(T)，大肠杆菌可采用Escherichia coli NCTC9001。

实施例2 多细胞体系DUT08微氧/厌氧发酵代谢特性及底物耐受情况

将实施例1中获得的多细胞体系DUT08经种子培养基培养后，按10％体积比接 种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中培养，批式发酵在初始甘油浓度为40-140g/L (粗甘油53-187g/L)中进行，结果见图2(图2A:0.00vvm，图2B：0.02vvm)。发酵 结果表明，多细胞体系DUT08在N2通入量为0.00vvm条件下，最高可耐受120g/L 甘油，发酵产物主要以1,3-丙二醇和乳酸为主。120g/L初始甘油浓度时1,3-丙二醇浓 度达到43.2g/L，乳酸浓度为26.38g/L，1,3-丙二醇和乳酸总的质量转化率为0.63g/g。 其它代谢副产物为乙酸、丁酸、琥珀酸和甲酸，分别为8.94g/L、2.73g/L、3.24g/L 和4.71g/L。在N2通入量为0.02vvm时具有更高的底物耐受性，可在甘油含量为140 g/L的粗甘油中生长代谢，代谢产物以1,3-丙二醇、丁酸和乙酸为主。当初始甘油浓度 为120g/L时，1,3-丙二醇浓度达到58.33g/L，转化率为0.52g/g，生产强度为1.90 g/(L·h)，丁酸和乙酸分别为7.42g/L和7.90g/L。初始甘油浓度为140g/L时，细胞生 长受到一定的抑制，60h后，有41.62g/L甘油未消耗完，最终1,3-丙二醇浓度为42.66 g/L。

实施例3 多细胞体系DUT08在不同N2通入量时生长及代谢情况

将实施例1中获得的多细胞体系DUT08经种子培养基培养后，按10％体积比接种 至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中培养，初始底物浓度为120g/L，通气量为 0-0.2vvm，接种前后分别通气1h和2h，发酵结果见图3。发酵结果表明，随着通气量 的增加，多细胞体系DUT08发酵生产1,3-丙二醇的能力逐渐提高，当通气量为0.1vvm 时，1,3-丙二醇产量最高为61.80g/L，转化率为0.55g/g，生产强度为2.12g/(L·h)。当 通气量提高至0.2vvm时，1,3-丙二醇产量为61.49g/L，转化率为0.55g/g，生产强度 提高至2.46g/(L·h)，随着通气量的逐渐增加，代谢副产物乳酸的量降低，代谢流更多 的流向丁酸和1，3-丙二醇，表明肺炎克雷伯氏杆菌代谢甘油途径减慢，主要以丁酸 梭菌为主利用甘油代谢途径，产生丁酸作为主要代谢副产物。

实施例4 厌氧多细胞体系DUT08-C以120g/L甘油为底物的批式发酵生长及代谢情 况

将实施例1中获得的多细胞体系DUT08经种子培养基培养后，在90℃水浴锅中 处理15min，按10％接种量接种至种子培养基中培养48h获得一级种子，将一级培养 物继续按5％接种量转接，转接时间缩短至24h，以24h为传代周期连续传代至第10 代，得到由梭状芽胞杆菌属组成的发酵性能稳定的多细胞体系DUT08-C。

将简化后的多细胞体系DUT08-C经种子培养基培养后，按10％体积比接种至装 有2L发酵培养基的5L发酵罐中培养，初始甘油浓度为120g/L在接种前1h通入0.2 vvm N2，接种后持续2h，发酵结果见图4。由图4可知，与DUT08相比，DUT08-C 的1,3-丙二醇生产能力较弱，其产量、生产强度和转化率分别为43.97g/L，0.93g/(L.h) 和0.53g/g，代谢副产物主要是丁酸和乙酸，含量分别为5.45g/L和6.80g/L。研究结 果表明多细胞体系DUT08中的其它菌如克雷伯氏杆菌和大肠杆菌对丁酸梭菌代谢甘 油生产1,3-丙二醇具有协同促进作用。

实施例5 厌氧菌Clostridium butyricum DUT1以120g/L甘油为底物的批式发酵生长 及代谢情况

将实施例1中获得的厌氧微生物C.butyricum DUT1经种子培养基培养后，按10％ 体积比接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中培养，初始底物浓度为120g/L在接 种前1h通入0.2vvm N2，接种后持续2h，结果见图5。C.butyricum DUT1纯种培 养时，1,3-丙二醇产量、生产强度和转化率分别为48.79g/L、1.06g/(L.h)和0.53g/g， 46h后，仍残留33.37g/L甘油。单菌C.butyricum DUT1转化粗甘油的能力与由羧菌 属组成的微生物菌群DUT08-C的生产能力相似，和多细胞体系DUT08相比，该菌株 的1,3-丙二醇产量下降了20.65％，发酵时间延长了21h，生产强度下降了56.91％。

实施例6 兼性菌Klebsiella pneumonia DUT2以120g/L甘油为底物微氧/厌氧批式发 酵生长及代谢情况

将实施例1中获得的兼性微生物菌株K.pneumonia DUT2经种子培养基培养后， 按10％体积比接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行微氧(0.0vvm N2)和厌 氧培养(0.2vvm N2)，初始底物浓度为120g/L，代谢结果见图6。微氧和厌氧条件下， K.pneumonia DUT2表现出来代谢甘油的能力非常相似。其中厌氧条件下，34h后， 共消耗了115.51g/L甘油，1,3-丙二醇的最终浓度为44.86g/L，相对于甘油的转化率 为0.39g/g，代谢副产物主要是乳酸和乙酸，分别为17.38g/L和9.53g/L。在微氧条件 下，32h后，共消耗了108.12g/L甘油，1,3-丙二醇的最终浓度为45.09g/L，相对于 甘油的摩尔转化率为0.42g/g，微氧条件下，K.pneumonia DUT2产生更多的乳酸，乳 酸含量相当于厌氧条件，增加了21.75％。研究结果表明，微氧条件更有利于K. pneumonia DUT2的生长代谢，其在多细胞体系DUT08代谢甘油生产1,3-丙二醇过程 中，一方面为Clostridium butyricum DUT1生长代谢提供了厌氧环境，一方面与Clostridium butyricum DUT1一起代谢甘油生产1,3-丙二醇。二者的合作，最终实现多 细胞体系DUT08高效转化粗甘油生产1,3-丙二醇。

实施例7 好氧菌Escherichia coli DUT3以120g/L甘油为底物批式发酵生长及代谢情 况

将实施例1中获得的好氧微生物菌株E.coli DUT3经种子培养基培养后，按10％ 体积比接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中培养，初始底物浓度为40g/L。研 究结果表明，该菌利用甘油能力较弱，当残余甘油浓度为36.40g/L时，该菌便进入了 衰亡期，产物中仅检测到乙醇，乙酸和琥珀酸，其浓度分别为2.08，0.82和1.03g/L。 表明好氧菌E.coli DUT3在多细胞体系DUT08中的主要作用是消耗发酵培养基中的溶 氧，为严格厌氧的丁酸梭菌提供相对厌氧的环境，使其在不通气的情况下可生长代谢。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都 可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为 等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技 术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术 方案保护的范围内。