本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料制备二十二碳六烯酸的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是一种人体必需的多不饱和脂肪酸，必须从膳食中补充。DHA是中枢神经系统和视网膜的重要结构脂成分，具有健脑、提高记忆力和视力的功能，尤其是可以促进胎儿和婴幼儿脑细胞发育生长，提高青少年记忆力，防治老年性痴呆等等。传统上，DHA主要来源于深海鱼油，但由于受过度捕捞、环境污染、季节变化等的影响很大，逐渐被利用微生物发酵生产所取代。在现阶段，工业化DHA生产主要的通过裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)发酵实现，其总脂肪酸中DHA含量高达40％-60％。2010年利用裂殖壶菌生产的DHA藻油已被卫生部批准为新资源食品。
目前国内涉及提高裂殖壶菌发酵制备DHA油脂产能和经济性的专利主要包括三方面内容：1)通过筛选裂殖壶菌菌株选育获得到生物量高、生长速率高和高DHA含量的菌种，如专利CN 1264967 C、CN 101892160 B、CN 103602591 A、CN 101575584 B、CN 102199541 B、CN 102899254 A、CN 102888348 A以及CN 102864111 B。2)通过改变培养基中的组分，如制备全合成培养基，优化维生素及微量元素含量，降低氯含量和添加外源脂相容性物质如海藻糖、甜菜碱等方式，达到提高DHA产量的目的，如CN 101993824 A、CN 101831387 B、CN 101886044 A、CN 101914581 B和CN 103627640 A。3)通过优化发酵工艺方式降低生产成本，提高产物得率。如CN 101519676 B、CN 101812484 B、CN 101824442 B、CN 102972533 A、CN103146584 A以及CN 103614427 A。然而，上述方法都是以玉米淀粉来源的葡萄糖作为主要碳源，因此葡萄糖的供给和原料成本是影响DHA产能和经济性的主要限制因素。因此，开发低成本新型碳源以及配套的生物制备技术具有必要性和广阔的应用前景。
木质纤维素是一类供应丰富且环境友好的可再生生物质，包括秸秆、废纸浆、稻壳、酒糟等农林废弃物。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成。其中，纤维素是由葡萄糖组成的。因此，木质纤维素生物质是潜在的廉价葡萄糖原料，发展以木质纤维素原料为底物的葡萄糖酸钠的生产方法，可以显著降低DHA的生产成本，并同时解决农林废弃物的综合利用问题。
目前，木质纤维素制备DHA技术中，一般都是采用真菌来源的纤维素酶。发明专利2013105714130提供了“利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六稀酸的方法”。采用真菌来源的纤维素酶、半乳糖苷酶和果胶酶对预处理后的秸秆进行水解，再利用水解液进行裂殖壶菌发酵生产DHA。采用真菌来源的酶制剂的策略存在效率和成本上的不足，这主要因为纤维素酶制剂的需要在单独的反应器中通过微生物发酵制备，且制备的工艺与纤维素水解条件不同，生产步骤繁琐复杂，人力物力需求和设备投入等成本显著增加，使得木质纤维素的糖化过程不具有市场竞争力，因此基于真菌来源纤维素酶制剂的糖化以及DHA制备技术难以实现大规模的工业应用。发明专利2015108721949提供了一种直接利用甘蔗渣水解液进行裂殖壶菌发酵的方法，其底物甘蔗渣经过稀酸水解得到水解液而非酶水解法，存在环境污染的潜在危险；另外，由于水解液中的糠醛等物质具有强烈的抑制生长的作用，需要特殊的裂殖壶菌菌种才能在该水解液中直接生长，且菌体生物量与油脂或DHA产量较低。
已知纤维小体是热纤梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。纤维小体包括脚架蛋白等非催化单元以及具有不同催化活性的酶单元，并通过多级脚架蛋白和不同纤维小体酶类具有的多类型组装模块间特异性的非共价相互作用，将不同的功能组分组装成为分子量超过兆道尔顿的超分子多酶复合体。纤维小体组分和结构还具有时空调控特性，以适应木质纤维素的复杂成分，从而保证了其高效降解活力。此外，纤维小体还通过脚架蛋白或纤维素酶上所具有的纤维素结合模块和挂壁模块与底物及细胞组成三元复合体，纤维小体和细胞间的协同作用可以进一步提高了木质纤维素的糖化效率(专利文件EP2013355)。
尽管纤维小体及其生产菌株在木质纤维素糖化应用中具有巨大潜力，但其工业化应用仍受到多种因素的限制。当木质纤维素复杂底物中非纤维素成分(如，半纤维素、果胶、淀粉、蛋白质、木质素)含量较高时，糖化效率显著降低。前人主要通过向水解体系里额外添加非纤维小体蛋白来提高纤维小体的活力和对底物的适应力。然而，由于外源添加的蛋白的活性及稳定性会随着糖化过程的进行而降低，因此，酶的消耗需要提高酶添加量或添加次数。此外，这些非纤维小体蛋白作为游离酶添加到糖化体系中，不能与纤维小体相互作用，会显著降低与体系中其他酶的协同作用，不可避免造成大于需求量的酶的额外添加，导致酶制剂成本的居高不下。不仅如此，这种依赖于外源添加游离酶的糖化策略，工艺复杂，对设备要求高，转化效率还不能满足工业化生产要求。
技术实现要素：
针对现有技术中在工业化生产DHA方面所存在的问题，本发明提供了以木质纤维素类农林废弃物为原料生产DHA的工艺，所述工艺采用了用于催化木质纤维素糖化的纤维素酶制剂，从而降低了DHA发酵的碳源成本。
本发明的技术方案：采用木质纤维素制备DHA的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使pH控制在5.8-6.2。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在28-38℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵36-80h，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，在28-38℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵80-120h，获得裂殖壶菌发酵液。
所述的发酵培养基为：玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，海水晶30g/L，维生素B15mg/L，维生素B6 5mg/L，维生素B12 5mg/L，生物素5mg/L、pH 6.5-7.5。
(4)DHA提取：将步骤(3)得到的裂殖壶菌发酵液离心处理，将裂殖壶菌菌体细胞与发酵后培养基进行固液分离，利用有机溶剂萃取法从裂殖壶菌菌体细胞中提取得到DHA。
所述方法还包括步骤(5)，具体为：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释，用于配制步骤(2)的糖化培养基。
其中，步骤(2)所述的纤维素酶制剂，是通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到的；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。所述的纤维小体中的组分为脚架蛋白、有催化功能的酶、组装模块。
所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。
优选的是，所述非纤维小体蛋白具有序列表SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列；以及与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQ ID NO:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中：SEQ ID NO:15:Genbank序列号CRZ35393.1；SEQ ID NO:16:由基因组CP001393.1中1968724至1973904核酸序列编码；SEQ ID NO:17:Genbank序列号为KC763474.1；SEQ ID NO:18:由基因组CP001393.1中2531445至2532785核酸序列编码。
优选的是，所述厌氧细菌为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)，黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)，嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)，解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)，解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)，黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)。其中，所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接，具体为：非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中。所述与非纤维小体蛋白和纤维小体组分共价相互作用的多肽片段为SEQ ID NO:4中所示的碱基序列或SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的一个片段(多肽片段I或II，即SEQ ID NO:4或5)的编码基因；
2)根据1)，通过基因克隆的方法，连接纤维小体组分蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的另一个片段(多肽片段II或I，即SEQ ID NO:5或4)的编码基因。
3)根据1)，将非纤维小体蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒；
4)根据2)，将纤维小体组分蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌同源重组质粒，并根据基因组序列设计同源臂。
5)将4)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现重组基因序列对基因组上原始纤维小体组分蛋白序列的替换，从而构建重组菌株，实现纤维小体组分蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
6)将3)中获得的质粒转化到5)中获得的重组菌株中，实现非纤维小体蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，基因组表达的纤维小体组分蛋白与质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的多肽片段I及II间的特异性共价相互作用实现共价交联，并组装在纤维小体复合体中。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接，具体为：非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中。所述融合表达为：非纤维小体蛋白的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的N端、C端或结构域序列中间的基因组上。
所述各自呼应的模块为粘连模块与对接模块。所述对接模块为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9-13、SEQ ID NO:14中所示的碱基序列，粘连模块为SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与I型对接模块(SEQ ID NO:6)的编码基因，或
2)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与II型粘连模块(SEQ ID NO:7)的编码基因
3)将1)或2)获得非纤维小体蛋白与组装模块的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒
4)将3)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，实现非纤维小体蛋白与I型对接模块或II型粘连模块在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的I型对接模块或II型粘连模块实现与纤维小体脚架蛋白进行特异性非共价相互作用，从而组装在纤维小体复合体中。
所述直接融合表达的具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，将非纤维小体蛋白的编码基因连接到产纤维小体细菌同源重组质粒中，并根据基因组序列设计同源臂。
2)将1)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现非纤维小体蛋白的编码基因插入到基因组上纤维小体组分蛋白的序列的N端或C端或结构域序列中间，从而构建重组菌株，实现非纤维小体蛋白与纤维小体组分蛋白在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，非纤维小体蛋白利用与其融合表达的纤维小体组分蛋白的组装模块结合到纤维小体复合体中。
优选的是，步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于12％。
优选的是，步骤(2)糖化步骤中的温度条件为55-60℃，水解体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。
优选的是，步骤(3)中，当葡萄糖浓度为60-150g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器。
优选的是，步骤(4)中具体为，在30-35℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵48-80h，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，在30-35℃的温度条件、补氮且6.5-7.0的pH条件下发酵100-120h，所述补氮操作具体为：流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
优选的是，步骤(5)中所述的有机溶剂萃取法具体为：采用乙醇和正己烷的混合液提取DHA。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了以木质纤维素为原料发酵生产DHA的工艺，具有原料来源广泛且廉价的优势，具有极强的市场竞争力，将在很大程度上解决逐年增加的市场需求。
(2)与现有采用玉米淀粉来源的葡萄糖作为碳源发酵生产DHA相比，本发明所述的工艺采用木质纤维素生物糖化与裂殖壶菌高密度发酵相结合；通过采用木质纤维素生物质为原料，一方面显著降低了DHA的生产成本，另一方面还解决了农林废弃物的综合利用问题。与现有的利用木质纤维素制备DHA的技术相比，本发明所述工艺采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，显著降低了糖化阶段的用酶成本。
(3)本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果；这两点在产业上具有重要的意义，不但具有巨大的经济效益，而且环境友好，必然可以走的更加长远。
(4)本发明所述的工艺中，纤维素糖化效率为80％-90％，裂殖壶菌生物量可达到15-80g/L，DHA产量为5-25g/L。与现有技术相比，具有更高的DHA产量和得率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
通过无缝克隆，将tdk表达盒(包含gapDH基因的启动子)以及pyrF表达盒(包含pyrF自身启动子)克隆到质粒pHK(Mohr,G.,Hong,W.,Zhang,J.,Cui,G.-Z.,Yang,Y.,Cui,Q.,et al.(2013)A targetron system for gene targeting in thermophiles and its application in Clostridium thermocellum,PLoS One 8:e69032.)的抗生素基因cat的下游，并通过引物的设计，在tdk与pyrF表达盒之间增加NheI和XbaI酶切位点，在pyrF下游添加EagI和MluI酶切位点，用于同源臂片段的克隆，从而构建得到pHK-HR质粒。
选择热纤梭菌纤维小体中的纤维素酶Cel9K(外切纤维素酶，由基因组CP002416.1中2113813至2111293核酸序列编码)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶BglA(Genbank序列号为AFO70070.1)编码基因作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组质粒pHK-HR-BglA。上游同源臂HR-up序列为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中2111347到2112870核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2109848到2111354核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中2111347到2111659核酸序列。其次，将构建好的质粒转化到ΔpyrF中，并按照三步筛选获得底盘菌株。具体筛选方法为：
1)将同源重组质粒pHK-HR转化进入pyrF缺失的菌株中，利用含甲砜氯霉素的GS-2半固体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,酵母提取物6.0g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,pH 7.4)平板进行筛选，以获得质粒转化子。
2)获得的转化子在MJ液体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,盐酸吡哆胺2mg/L,生物素0.2mg/L,对氨基苯甲酸0.4mg/L，维生素B12 0.2mg/L，pH 7.4)中转接三代后，涂布含10μg/mL 5-氟脱氧尿苷(FUDR)的MJ半固体培养基进行第一次同源重组筛选。在这一步骤中，由于Tdk可以将FUDR转化为对细胞有毒的F-dUMP，同时底盘细胞在MJ培养基中必须依靠质粒上的pyrF基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。
3)经第一次同源重组后获得的重组子先在GS-2液体培养基中传代3次，并用相同的培养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/mL 5-氟乳清酸(FOA)的GS-2半固体培养基进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，PyrF的反向筛选作用会促使上游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrF表达框从基因组中去除。第二次同源重组后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除、敲入或者替换。分别获得同源重组菌株ΔpyrF-I或ΔpyrF-II，分别表达Cel48S与多肽片段I或多肽片段II的融合蛋白。
选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶Cel48S(由基因组CP002416.1中3228088至3230229核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点，将多肽片段I(SEQ ID NO:4)或多肽片段II(SEQ ID NO:5)两个片段的编码序列作为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点分别克隆到同源重组质粒pHK-HR中，分别构建获得同源重组质粒pHK-HR-I或pHK-HR-II。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中3230200到3230700核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中3229699到3230199核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中3230200到3230500核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到上述构建的底盘菌株中，并按照上述三步筛选方法获得同源重组菌株ΔpyrF::BglA-I或ΔpyrF::BglA-II。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将多肽片段II或多肽片段I连接到木聚糖酶XynA(SEQ ID NO:1)的3’端。利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上。将含有XynA与多肽片段I的重组序列的表达质粒转化到ΔpyrF::BglA-II；将含有XynA与多肽片段II的重组序列的表达质粒转化到ΔpyrF::BglA-I，从而实现Cel48S和XynA能够通过多肽片段I和II间特异性共价相互作用进行结合。通过提取获得热纤梭菌重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的XynA可以外泌到胞外，并与具有共价结合模块的Cel48S相互作用，组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例2：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例1不同的是，将多肽片段II或多肽片段I连接到纤维小体内切酶CelZ(SEQ ID NO:15)的3’端。将构建的重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例3：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel9-48(SEQ ID NO:16)与热纤梭菌的II型粘连模块CohIIct的序列(SEQ ID NO:7)或I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中CohIIct或DocIct的序列连接至Cel9-48序列的3’端，获得Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列。
以Cel9-48-DocIct或Cel9-48-CohIIct序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1160为靶向替换序列，构建同源重组质粒pHK-HR-cel9-48。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中1380180到1380679核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1380634到1381133核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中1380833到1381133核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到实施例1构建的底盘菌株中，并按照实施例1的三步筛选方法获得同源重组菌株1和2。通过提取重组菌株的纤维小体发现，Cel9-48与组装模块的融合蛋白可以外泌到胞外，并通过非共价交联的相互作用方式组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例4：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将膨胀因子Epn(SEQ ID NO:2)编码基因作为目标序列，选择热纤梭菌纤维小体的脚架蛋白SdbA(由基因组CP002416.1中1108113至1109912核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点构建同源重组质粒pHK-HR-epn。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中1107610到1108109核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中1109916到1110415核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中1107809到1108109核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将木聚糖酶XynA(SEQ ID NO:1)与II型粘连模块CohII的序列(SEQ ID NO:7)直接连接起来，其中CohII的序列连接至XynA序列的3’端，从而获得XynA-CohII的序列。以XynA-CohII序列为目标序列，利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1878为靶向替换序列，构建同源重组质粒pHK-HR-xynA。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中2194853到2195353核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2196312到2196811核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中2195053到2195353核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与热纤梭菌的I型对接模块DocIct的序列(SEQ ID NO:6)直接连接起来，其中DocIct的序列连接至PelA序列的3’端，获得PelA-DocIct目标序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上，获得表达质粒pHK-PcelS-PelA-DocIct。由于pHK上带有来源于热纤梭菌的纤维素酶Cel48S的启动子及信号肽序列(SEQ ID NO:8)，表达的目标基因可以外泌到细胞胞外。
将同源重组质粒pHK-HR-xynA转化到实施例3构建的重组菌株1中，并按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株3。再将同源重组质粒pHK-HR-epn转化到重组菌株3中，同样的按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株重组菌株4。最后，将质粒pHK-PcelS-PelA-DocIct转化到重组菌株4中，从而获得同时表达具有II型粘连模块的XynA、具有I型对接模块的Cel9-48和PelA以及融合蛋白Epn-SdbA的热纤梭菌重组菌株5。
通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的木聚糖酶XynA、纤维素外切酶Cel9-48、果胶酶PelA都通过直接性连接的方式结合在热纤梭菌纤维小体上、膨胀因子Epn通过与脚架蛋白SdbA的融合表达也可以外泌并组装到纤维小体复合体中。将重组菌株5在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例5：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将实施例4构建的重组菌株5，在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例6：通过直接性连接的方法，构建基于黄色溶纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶Cel48S与黄色溶纤梭菌的I型对接模块序列DocIccl(SEQ ID NO:9)连接起来，其中DocIccl的序列连接至Cel48S序列的3’端，从而获得Cel48S-DocIccl序列。再利用BamHI和XbaI酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒pHK上。构建好的质粒转化到黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum DSM 19732)中获得表达的具有DocIccl的Cel48S重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIccl的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄色溶纤梭菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例7：通过直接性连接的方法，构建基于白色瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与白色瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIra(SEQ ID NO:10)连接起来，从而获得Cel48S-DocIra序列。构建好的质粒转化到白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus SY3)中获得表达的具有DocIra的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIra的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到白色瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例8：通过直接性连接的方法，构建基于黄化瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与黄化瘤胃球菌的I型对接模块序列DocIrf(SEQ ID NO:11)连接起来，从而获得Cel48S-DocIrf序列。构建好的质粒转化到黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)中获得表达的具有DocIrf的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIrf的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到黄化瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例9：通过直接性连接的方法，构建基于溶纤维假拟杆菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶Cel48S与溶纤维假拟杆菌的I型对接模块序列DocIpc(SEQ ID NO:13)连接起来，从而获得Cel48S-DocIpc序列。构建好的质粒转化到溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens DSM 2933)中获得表达的具有DocIpc的Cel48S的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有DocIpc的Cel48S可以外泌到胞外，并组装到溶纤维假拟杆菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例10：通过直接性连接的方法，构建基于嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将蛋白酶ProL(SEQ ID NO:3)编码基因作为目标序列，选择嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶Clocel_2823(由基因组CP002160.1中3464080至3466140核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。利用MluI和EagI的酶切位点克隆到同源重组质粒pHK-HR中，构建同源重组质粒pHK-HR-ProL。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridium cellulovorans 743B基因组中(NCBI数据库中序列号为CP002160.1)中3466141到3466640、3465641到3466140以及3466141到3466441核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失的743B突变株中，并按照实施例1的方法筛选获得蛋白酶ProL与纤维素酶Clocel_2823融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例11：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将淀粉酶AmyA(SEQ ID NO:17)编码基因作为目标序列，选择解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶Ccel_0729(由基因组CP001348.1中843122至845197核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。同源臂HR-up、HR-down和HR-short分别为Clostridium cellulolyticum H10基因组中(NCBI数据库中序列号为NC_011898)中842441到842941、842942到843441以及842641到842941核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrF缺失的H10突变株中，筛选获得淀粉酶AmyA与纤维素酶Ccel_0729融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例12：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维醋弧菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将果胶酶PelA(SEQ ID NO:18)编码基因与解纤维醋弧菌的I型对接模块序列DocIac(SEQ ID NO:14)连接起来，从而获得PelA-DocIac序列。构建好的质粒转化到解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)中。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的PelA可以外泌到胞外，并通过具有的DocIac组装到解纤维醋弧菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例13：采用木质纤维素制备DHA
(1)预处理：对玉米秸秆按照文献(中国造纸，2015,34,1-6)中采用的磺化法进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:6，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的6L培养基中，然后将实施例1制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在55℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使pH控制在5.8-6.2。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到70-80g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在28℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵48h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。
所述的发酵培养基为：玉米浆10g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，海水晶30g/L，维生素B1 5mg/L，维生素B6 5mg/L，维生素B12 5mg/L，生物素5mg/L、pH 6.5-7.5。
(4)DHA提取：将步骤(3)得到的裂殖壶菌发酵液离心处理，将裂殖壶菌菌体细胞与发酵后培养基进行固液分离，采用乙醇和正己烷的混合液提取的有机溶剂萃取法从裂殖壶菌菌体细胞中提取得到DHA。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释，直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例14：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对小麦秸秆按照专利CN201610133959中采用的水热与磺化法联合预处理法进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3.5，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的350L培养基中，然后将实施例2制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到140-150g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵80h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆20g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例15：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对灌木枝条按照文献(Bin Li,et al.Recent progress on the pretreatment and fractionation of lignocelluloses for Biorefinery at QIBEBT.Journal of Bioresources and Bioproducts,2017,2(1),4-9)中的碱法预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于7.5％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5L培养基中，然后将实施例3制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到90-110g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵48h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆15g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例16：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对木片按照文献(Biotechnology for Biofuels，2014，7:116)中的碱法与水热相结合的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:8，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的800L培养基中，然后将实施例4制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-70g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵100h，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。所述的发酵培养基含玉米浆8g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例17：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对稻草按照文献(纤维素科学与技术，2002，3，47-52)中的汽爆预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于14.5％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的1000L培养基中，然后将实施例5制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在58℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到50-60g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在35℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵120h，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。所述的发酵培养基含玉米浆8g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例18：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照文献(Bioresource Technology，2004，91，93-100)中的水热预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例6制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到160-180g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在35℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵115h，连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。所述的发酵培养基含玉米浆20g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例19：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:15，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的3L培养基中，然后将实施例7制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到30-50g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵36h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆5g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例20：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例8制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到40-60g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵42h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆8g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例21：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例14预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:4.5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的4.5L培养基中，然后将实施例9制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到110-130g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在32℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵115h，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。所述的发酵培养基含玉米浆20g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例22：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照文献(生物加工过程，2010，3，66-72)中的稀酸水解预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于9％，半纤维素含量不高于18％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将0.4kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2L培养基中，然后将实施例10制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在42℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-80g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在32℃的温度条件、7.0的pH条件下发酵80h，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/L，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。所述的发酵培养基含玉米浆10g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例23：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于9％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:25，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5L培养基中，然后将实施例11制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-35g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在30℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵36h，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆5g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例24：采用木质纤维素制备DHA
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于5％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的0.6L培养基中，然后将实施例12制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)裂殖壶菌发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到100-120g/L后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的裂殖壶菌种子液，在38℃的温度条件、6.5的pH条件下发酵50，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/L时发酵结束。所述的发酵培养基含玉米浆15g/L。
(4)DHA提取：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍，然后直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
表1.实施例13-24采用木质纤维素制备DHA的结果列表
由表1可知，实施例13-24中采用木质纤维素制备DHA的方法，所得葡萄糖的产量为27.1-179.2g/L，纤维素糖化率为80.10-90.80％，裂殖壶菌生物量为15.83-81.68g/L，DHA产量为5.15-25.03g/L，培养基再利用后的纤维素糖化率为80.50-89.5％。这说明，本发明所述的采用木质纤维素制备DHA的方法，不但具有原料来源广泛且廉价的优势，而且通过木质纤维素生物糖化与裂殖壶菌高密度发酵相结合，实现了高的DHA的产量和得率。此外，与第一轮的纤维素糖化率相比，培养基再利用后的纤维素糖化率相差无几，说明本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果。
因此，本发明所述的采用木质纤维素制备DHA的方法解决了现有技术中制备DHA所存在的原材料和酶制剂成本高、制备工艺不环保、DHA产率较低的问题，将产生巨大的经济效益，具备广阔的市场前景。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 采用木质纤维素制备DHA的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> 热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor sp. )
<400> 1
Ala Ile Thr Leu Thr Ser Asn Ala Ser Gly Thr Tyr Asp Gly Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Ser Gly Asn Thr Thr Met Thr Val Asp Thr
20 25 30
Gly Gly Arg Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Leu Phe
35 40 45
Arg Thr Gly Lys Lys Phe Asn Thr Ala Trp Asn Gln Leu Gly Thr Val
50 55 60
Lys Ile Thr Tyr Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu
65 70 75 80
Cys Ile Tyr Gly Trp Ser Lys Asn Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Thr
100 105 110
Val Thr Ile Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Val
115 120 125
Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Thr Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser
130 135 140
Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Asp His
145 150 155 160
Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys Gly Leu Asn Leu Gly Thr Ile Asp Gln
165 170 175
Ile Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Ile
180 185 190
Thr Gln Asn Thr Phe Ser Ile Thr Ser Asp Ser Ser Gly Ser Thr Thr
195 200 205
Pro Thr Thr Thr
210
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)
<400> 2
Met Asn Phe Lys Lys Ile Arg Leu Phe Thr Ala Ile Leu Ile Ile Ala
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Ser Tyr Asn Phe Ile Ser Ser Ala Gln Leu Gln Val
20 25 30
Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Asn Val Asp Ser Ile Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Met Lys Ser Phe Ile Leu Lys Ile Ile Asn Thr Leu Pro Ala Glu Asp
50 55 60
Ser Leu Leu Ala Gly Asp Leu Asp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Ser Ile
65 70 75 80
Asp Cys Ala Leu Met Lys Gln Tyr Leu Leu Gly Met Ile Lys Val Phe
85 90 95
Pro Lys Thr Gln Ser Pro Ala Pro Thr Pro Thr Asn Thr Pro Leu Pro
100 105 110
Glu Tyr Ser Glu Pro Tyr Pro Gly Trp Asp Lys Ile Arg Ser Gly Tyr
115 120 125
Ala Thr Tyr Thr Gly Ser Gly Tyr Val Gly Gly Ile Ala Leu Leu Asp
130 135 140
Pro Ile Pro Glu Asp Met Glu Ile Val Ala Val Asn Lys Pro Asp Phe
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Gly Val Gln Ala Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Leu Glu Val
165 170 175
Thr Gly Pro Lys Gly Thr Thr Val Val Tyr Val Thr Asp Cys Tyr Thr
180 185 190
Glu Ala Pro Glu Gly Ala Leu Asp Leu Cys Gly Ile Ser Cys Asp Lys
195 200 205
Ile Gly Asp Thr Asn Val Pro Gly Gly Lys Ile Asp Val Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Ile Pro Ala Pro Ile Thr Gly Asn Phe Ile Tyr Arg Ile Leu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Ser Lys Trp Trp Phe Ala Ile Gln Val Arg Asn His Lys Tyr
245 250 255
Pro Val Met Lys Met Glu Tyr Phe Lys Asp Gly Glu Trp Val Asp Ile
260 265 270
Pro Lys Asp Arg Cys Asn Tyr Phe Val Ile Asn Asn Leu Asp Thr Ser
275 280 285
Asn Leu Lys Ile Arg Ile Thr Asp Ile Arg Gly Lys Val Val Thr Asp
290 295 300
Ile Ile Asp Pro Ile Pro Asp Asn Leu Met Asn Gly Cys Phe Ile Gln
305 310 315 320
Gly Asn Val Gln Phe Pro Asp
325
<210> 3
<211> 440
<212> PRT
<213> 溶蛋白杆菌(Coprothermobacter proteolyticus)
<400> 3
Met Lys Lys Ile Leu Leu Thr Leu Val Ile Ala Val Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Phe Ala Gly Val Lys Ser Ala Glu Leu Leu Phe Val Ser Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Thr Asn Gln Glu Asp Pro Glu Asn Glu Ile Ile Val Gly Tyr
35 40 45
Lys Glu Asn Thr Asp Val Ala Val Leu Ser Lys Gln Val Glu Lys Thr
50 55 60
Thr Gly Ala Lys Leu Ser Arg Lys Gly Leu Lys Asn Phe Ala Val Phe
65 70 75 80
Lys Leu Pro Gln Gly Lys Ala Ala Asp Val Val Met Asn Gln Leu Lys
85 90 95
Asn Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Pro Asn Tyr Ile Ala His Ala
100 105 110
Phe Asp Val Pro Asn Asp Thr Phe Phe Asn Pro Tyr Gln Trp Asn Phe
115 120 125
Tyr Asp Tyr Gly Met Thr Ser Asn Gly Tyr Val Ser Asn Tyr Gly Ile
130 135 140
Gln Ala Val Ser Ala Trp Asn Ile Thr Lys Gly Ala Gly Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ile Ile Asp Thr Gly Val Ala Tyr Glu Asn Tyr Gly Ala Tyr Thr
165 170 175
Lys Ala Pro Asp Leu Ala Asn Thr Leu Phe Asp Thr Ala Asn Ala Tyr
180 185 190
Asp Phe Val Asn Asn Asp Thr His Ala Asn Asp Asp Asn Ser His Gly
195 200 205
Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Gln Ser Thr Asn Asn Gly Met Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ile Ala Tyr Gln Ala Thr Ile Leu Pro Ile Lys Val Leu
225 230 235 240
Asp Ser Glu Gly Ser Gly Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Asn Gly Ile Ile
245 250 255
Trp Ala Ala Asp Lys Gly Ala Arg Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
260 265 270
Ser Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Asn Ala Ile Gln Tyr Ala Tyr Asn
275 280 285
Lys Gly Val Val Ile Val Cys Ala Ser Gly Asn Asp Arg Arg Ser Thr
290 295 300
Val Ser Tyr Pro Ala Ala Tyr Thr Gln Cys Ile Ala Val Gly Ser Thr
305 310 315 320
Arg Phe Asp Gly Thr Arg Ala Arg Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser Ala Leu
325 330 335
Asp Ile Val Ala Pro Gly Gly Asp Thr Ser Val Asp Gln Asn His Asp
340 345 350
Gly Tyr Gly Asp Gly Ile Leu Gln Gln Thr Phe Ala Glu Gly Ser Pro
355 360 365
Thr Asp Phe Ala Tyr Tyr Phe Phe Gln Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
370 375 380
His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Leu Ser Ala His Pro Thr Tyr
385 390 395 400
Thr Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Leu Gln Ser Thr Ala Lys Asp Leu
405 410 415
Gly Thr Ala Gly Trp Asp Lys Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Val Asn Ala
420 425 430
Tyr Ala Ala Val Asn Trp Thr Pro
435 440
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 4
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 97
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 5
Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser
35 40 45
Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly
50 55 60
Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn
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Gly
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 6
Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser Thr Asp Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Lys Arg Tyr Val Leu Arg Ser Gly Ile Ser Ile Asn Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Asp Leu Asn Glu Asp Gly Arg Val Asn Ser Thr Asp Leu Gly
35 40 45
Ile Leu Lys Arg Tyr Ile Leu
50 55
<210> 7
<211> 160
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 7
Ser Ser Ile Glu Leu Lys Phe Asp Arg Asn Lys Gly Glu Val Gly Asp
1 5 10 15
Ile Leu Ile Gly Thr Val Arg Ile Asn Asn Ile Lys Asn Phe Ala Gly
20 25 30
Phe Gln Val Asn Ile Val Tyr Asp Pro Lys Val Leu Met Ala Val Asp
35 40 45
Pro Glu Thr Gly Lys Glu Phe Thr Ser Ser Thr Phe Pro Pro Gly Arg
50 55 60
Thr Val Leu Lys Asn Asn Ala Tyr Gly Pro Ile Gln Ile Ala Asp Asn
65 70 75 80
Asp Pro Glu Lys Gly Ile Leu Asn Phe Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile
85 90 95
Ala Gly Tyr Lys Glu Thr Gly Val Thr Glu Glu Ser Gly Ile Ile Ala
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Lys Ile Gly Phe Lys Ile Leu Gln Lys Lys Ser Thr Ala Val Lys Phe
115 120 125
Gln Asp Thr Leu Ser Met Pro Gly Ala Ile Leu Gly Thr Gln Leu Phe
130 135 140
Asp Trp Asp Gly Glu Val Ile Thr Gly Tyr Glu Val Ile Gln Pro Asp
145 150 155 160
<210> 8
<211> 891
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 8
tagtactatt aaagtcagac ttggttaaat ataaatttta tgacttgcat acaaacttga 60
tgtgtattat aataaaaata caaaacaaaa tagcaataat ttactcagtt atttttgaaa 120
tgggggtagt attaatatcg tataatgggg ttgcatatct gctgtctttc gaaaaaagca 180
caagaacttc aaatgtttcc atagtgaaat ttaaaaattg gagatttctt tgttgccccc 240
tcaaaaagta tatttttttc gaagatatat atatggaatt tattgattaa tttaagttat 300
taattttggc cttttagggt cgttgaaaac tgaatatgtt aagttgtttt gcgtgattca 360
gctgcatttg acgtaagact tcgccggtct gtttaaattc ccataataag atgtatttat 420
tgtagtaata atctggcatc tacaaatttc agtatttgca atagtctctg ttcaaaaaag 480
caattgtctt ttaaaccttt cagtattgtc ttcgtggcag tttcttttgt tatacgtcgt 540
tccgacaaaa aaatgtaaat ttatgtcaaa tgcgcggctg atttgataaa aaagtttgtt 600
aacacaaatt tattatgtta acacaagtat tttttgggtc cagcttagtt ttatgatgaa 660
aataatgcgt aaaatttatc cgcaaaaagg gggaatgaat ttattgcggg taggttgcat 720
tatttcatca tataacttaa aaagaataaa aaagtatatt tgaaagggga agatggagag 780
atggtaaaaa gcagaaagat ttctattctg ttggcagttg caatgctggt atccataatg 840
atacccacaa ctgcattcgc aggtcctaca aaggcaccta caaaagatgg g 891
<210> 9
<211> 59
<212> PRT
<213> 黄色溶纤梭菌(Clostridium clariflavum)
<400> 9
Tyr Gly Asp Leu Asn Gly Asp Lys Leu Val Asn Ser Ile Asp Phe Ala
1 5 10 15
Leu Leu Lys Ile Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Lys Glu Phe Pro Tyr Glu
20 25 30
Tyr Gly Ile Lys Ser Ala Asp Leu Asn Arg Asn Gly Glu Val Asp Ser
35 40 45
Ile Asp Phe Ala Ile Leu Arg Ser Phe Leu Leu
50 55
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> 白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)
<400> 10
Arg Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Val Val Asn Val Thr Asp Val Ala
1 5 10 15
Lys Ile Ala Ala His Val Lys Gly Lys Lys Ile Leu Thr Gly Asp Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55
<210> 11
<211> 56
<212> PRT
<213> 黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)
<400> 11
Tyr Gly Asp Ala Asn Cys Asp Gly Asn Val Ser Ile Ala Asp Ala Thr
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Ala Ile Leu Gln His Leu Gly Asn Arg Asp Lys Tyr Gly Leu Arg Ala
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<210> 12
<211> 54
<212> PRT
<213> 解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)
<400> 12
Tyr Gly Asp Tyr Asn Asn Asp Gly Ser Ile Asp Ala Leu Asp Phe Ser
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Ser Phe Lys Met Tyr Leu Met Asn Pro Val Arg Thr Tyr Thr Glu Val
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Leu Asp Leu Asn Ser Asp Asn Thr Val Asp Ala Ile Asp Phe Ala Ile
35 40 45
Met Lys Gln Tyr Leu Leu
50
<210> 13
<211> 57
<212> PRT
<213> 溶纤维假拟杆菌(Pseudobacteroides cellulosolvens)
<400> 13
Tyr Gly Asp Val Thr Gly Asp Gln Leu Val Thr Asp Ala Asp Lys Thr
1 5 10 15
Lys Val Ser Asn Tyr Ile Leu Gly Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Ala Ala Ala Asp Val Asn Gly Asp Gln Val Val Asn Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Thr Leu Ile Asn Arg His Ile Leu
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<210> 14
<211> 58
<212> PRT
<213> 解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)
<400> 14
Lys Gly Asp Val Asp Leu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Phe Gly
1 5 10 15
Lys Met Arg Leu Cys Leu Leu Gly Lys Ser Pro Ala Phe Thr Gly Gln
20 25 30
Ala Leu Asp Asn Ala Asp Leu Asn Asp Asp Gly Ala Phe Asn Ser Ile
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Asp Phe Gly Tyr Met Arg Lys Lys Leu Leu
50 55